基于网络药理学的人参、红参及黑参抗肺气虚的作用机制与物质基础研究

陈宏雨，刘琳琳，窦德强*

（辽宁中医药大学药学院·辽宁大连·116600）

肺气虚证[1]指肺气虚弱，呼吸无力，卫外不固，以咳嗽无力、气短而喘、自汗等为主要表现的虚弱证候。中医学认为，“肺主气，司呼吸”，“久病成虚”。而呼吸系统疾病如慢性支气管炎、肺气肿等，在其发病过程中，均可损伤肺气导致肺气虚证。慢性支气管炎(chronic bronchitis，CB)是指由感染或非感染因素引起的气管、支气管黏膜及其周围组织的慢性非特异性炎性反应。喘息、气急是呼吸系统疾病最常见的临床症状，也是中医肺气虚证的主要证候。故而近年越来越多的学者以慢性支气管炎及肺气肿为切入点对于肺气虚证诊断标准的量化与客观化做出了更深入的研究，相关理论与观点也愈渐成熟。如窦红漫[2]等为掌握肺气虚证的本质特征，通过对实验性肺气虚证大鼠气道病理组织学及超微结构观察发现，其基础病变为慢性支气管炎及肺气肿。

人参作为五加科多年生植物人参（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根和根茎，人参性味甘、微苦，微温。归脾、肺、心、肾经。大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智[3]。红参是由鲜人参经过浸润、清洗、分选、蒸制、晾晒、烘干炮制而成。黑参的炮制方法主要是将鲜人参在蒸制设备中，蒸煮后晾干反复进行9次，俗称“九蒸九曝”。经过炮制后红参与黑参中的化学成分及其生理活性均有所变化。有研究显示由于中药物质基础的复杂性，人参、红参以及黑参可能会通过多成分、多靶点治疗CB达到抗肺气虚的效果，以此来发挥整体调节作用，故而需要系统性地进行研究与探讨。

1 方法

研究策略：本文为探究人参、红参及黑参抗肺气虚的作用机制及物质基础，结合文献报道以肺气虚证常见基础病变慢性支气管炎为目的疾病，采用网络药理学方法进行较为深入的探索学习：①通过TCMSP并结合文献筛选人参、红参及黑参的活性成分与潜在靶点；②通过人类基因数据库Gene Cards搜集与CB相关的疾病靶点；③取得药物-疾病靶点交集后带入STRING数据库中得到PPI相互作用网络图；④利用Cytoscape3.6.1软件构建“药物-成分-疾病-靶点”互作网络；⑤利用计算机R语言技术以及对应数据库对药物-疾病共同作用靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.1 筛选药物活性成分与潜在靶点

利用中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，以口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18作为阈值对结果进行筛选，分别查找人参、红参的主要活性成分及与主要活性成分相关的潜在靶点。通过查阅文献[4-6]收集黑参中的活性成分，转化为标准SMILES格式，导入平台分析，设置属性为“homo sapiens”，将靶点概率值不小于0的分子作为该成分有效靶点。

1.2 确定慢性支气管炎疾病靶点

通过人类基因数据库Gene Cards(http://www.genecards.org/)搜集与CB相关的疾病靶点。

1.3 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络

将三味药和CB共同作用靶点带入STRING数据库中，以置信度分数score＞0.9为条件进行筛选，余参数不变，得到PPI相互作用网络图。

1.4 构建药物-成分-疾病-靶点网络

通过数据可筛选获得各药物活性成分潜在作用靶点及疾病靶点，则可得到两者的共同靶点，利用Cytoscape3.6.1软件构建“药物-成分-疾病-靶点”互作网络。

1.5 富集分析基因本体(GO)功能基因组百科全书（KEGG）通路

利用R 3.6.3(https://www.r-project.org)软件中Bioconductor(org.Hs.eg.db)合集对人参、红参和黑参及CB共同作用靶点进行GO和KEGG通路富集分析。P<0.05表示具有统计学意义。

2 结果

2.1 药物化学成分与相关靶点

2.1.1 人参的化学成分与相关靶点

在TCMSP数据库中进行检索筛选之后得到人参相关有效化合物46个，成分及靶点信息详见表1。

表1 人参化学成分及靶点信息

2.1.2 红参的化学成分与相关靶点

在TCMSP数据库中进行检索筛选之后得到红参相关有效化合物28个，成分及靶点信息详见表2。

表2 红参化学成分及靶点信息

2.1.3 黑参的化学成分与相关靶点

通过查阅文献进行筛选之后得到黑参相关有效化合物26个，成分及靶点信息详见表3。

表3 黑参化学成分及靶点信息

序号 化合物名称 靶点数目13 Ginsenoside Rg2 13 14 Ginsenoside Rg5 42 15 Ginsenoside Rg6 12 16 Ginsenoside Rh1 27 17 Ginsenoside Rh3 100 18 Ginsenoside Rh4 100 19 20(S)-Ginsenoside Rh2 36 20 20(R)-Ginsenoside Rh2 36 21 Ginsenoside Rs3 16 22 Ginsenoside F4 37 26 3-methoxy-4-hydroxybenzoic acid 35 25 3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid 26 24 2,5-dihydroxybenzoic acid 20 23 Salicylic acid 25

2.2 筛选慢性支气管炎疾病靶点

通过人类基因数据库Gene Cards检索CB的疾病作用靶点，将Relevance score设置为＞10，获得慢性支气管炎的人类相关作用靶点537个。

2.3 筛选治疗CB的潜在靶点

将获得的疾病靶点分别与人参、红参、黑参三种药物绘制韦恩图取得交集，即得到药物治疗疾病的潜在靶点，分别对应人参46个，红参39个，黑参53个，靶点信息详见表4。

表4 各药物治疗慢性支气管炎潜在靶点

2.4 蛋白相互作用（PPI）网络的构建

将所得药物-疾病的共同靶点人参46个，红参39个，黑参53个导入STRING中，构建三类参治疗CB潜在靶点PPI网络，详见图1-3。

2.5 药物-成分-疾病-靶点网络及靶点互作分析结果

将人参活性成分和作用靶点信息导入Cytoscape3.6.1软件，构建人参、红参、黑参治疗CB的“药物-成分-疾病-靶点”网络图，详见图4-6。通过可视化网络分别得出人参、红参、黑参治疗慢性支气管炎Degree排列在前10的成分，详见表5。

表5 人参、红参、黑参治疗CB主要有效成分

2.6 GO功能富集分析

2.6.1 人参GO功能富集分析

利用计算机R语言技术以及对应数据库对药物-疾病的46个共同靶点进行GO功能富集分析。根据P<0.05，于人参部分确定了77个GO条目，分析结果显示包括磷酸酶结合、半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、肽链内切酶活性、MAP激酶活性等生物过程。根据P值大小筛选前20个条目作出气泡图，详见图7。

2.6.2 红参GO功能富集分析

利用计算机R语言技术以及对应数据库对药物-疾病的39个共同靶点进行GO功能富集分析。根据P<0.05，于红参部分确定了69个GO条目，分析结果显示包括磷酸酶结合、蛋白酪氨酸激酶活性、泛素蛋白连接酶结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、细胞因子受体结合等生物过程。根据P值大小筛选前20个条目作出气泡图，详见图8。

2.6.3 黑参GO功能富集分析

利用计算机R语言技术以及对应数据库对药物-疾病的53个共同靶点进行GO功能富集分析。根据P<0.05，于黑参部分确定了74个GO条目，分析结果显示包括跨膜受体蛋白激酶活性、SH2域结合、生长因子结合、蛋白质磷酸化氨基酸结合、血小板衍生生长因子受体结合等生物过程。根据P值大小筛选前20个条目作出气泡图，详见图9。

2.7 KEGG通路富集分析

2.7.1 人参KEGG通路富集分析

使用DAVID数据库及计算机R语言技术对人参-CB的46个共同靶点进行KEGG通路分析，根据P<0.05并结合相关文献进行筛选，得到与CB相关通路135条（按P值大小列举前10条），详见表6。

表6 人参-CB-基因通路富集分析

2.7.2 红参KEGG通路富集分析

使用DAVID数据库及计算机R语言技术对红参-CB的39个共同靶点进行KEGG通路分析，根据P<0.05并结合相关文献进行筛选，得到与CB相关通路135条（按P值大小列举前10条），详见表7。

表7 红参-CB-基因通路富集分析

2.7.3 黑参KEGG通路富集分析

使用DAVID数据库及计算机R语言技术对黑参-CB的53个共同靶点进行KEGG通路分析，根据P<0.05并结合相关文献进行筛选，得到与CB相关通路130条（按P值大小列举前10条），详见表8。

表8 黑参-CB-基因通路富集分析

3 讨论

通过药物-成分-疾病-靶点网络互作图Degree值进行排序，人参中起主要治疗作用的前10种活性成分有人参皂苷Rh4、人参皂苷Rg5、山柰酚、人参皂苷Rh1、人参皂苷Ra2、三七皂苷R2、三七皂苷R6、人参皂苷Ra0、人参皂苷Ra1、人参皂苷Ra3；红参中则是人参皂苷Rh4、人参皂苷Rh1、三七皂苷R2、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Re、人参皂苷Rs1、β-谷甾醇；黑参中包括人参皂苷Rh3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5、人参皂苷F4、20（S）-人参皂苷Rh2、20（R）-人参皂苷Rh2、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rg3。

有报道称山柰酚具有明显的抗炎活性，如周运江[7]等发现山柰酚对于肥大细胞炎症反应具有显著的抑制效应，它能够抑制IKKβ的活化，抑制IκBα的磷酸化，阻止NF-κB(p65)进入细胞核内，进而影响相关炎症介质的释放。而β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等生物活性。Liao等[8]发现β‐谷甾醇可通过抑制表皮细胞、巨噬细胞中炎症小体NLRP3的激活，来抑制CAS1的产生及MAPK信号通路的活化，导致细胞中的TNF‐α、IL‐1β、IL‐6、IL‐8生成显著减少从而起到抗炎作用。大量研究表明人参皂苷具有抗炎、抗氧化、抗癌等药理活性，如研究报道[9]人参皂苷Rg5在人体内可代谢为人参皂苷Rh3，后者相较于前者更具生物活性。Lee等[10]研究发现，Rh3增强了LPS诱导的5′-腺苷单磷酸激活蛋白激酶(AMPK)的磷酸化，抑制了Akt和janus激酶1/信号传感器和转录激活因子1(JAK1/STAT1)，通过上调sirtuin 1(SIRT1)而抑制核因子-κB(NF-κB)来增强Nrf2 dna结合活性，提示人参皂苷Rh3在脂多糖(LPS)刺激下的小胶质细胞中具有抗炎作用。Jung[11]等研究表明，Rh1可抑制IFN-γ诱导的JAK/STAT和ERK信号通路及其下游转录因子，从而抑制iNOS基因的表达，则Rh1可能对于治疗各种神经炎症性疾病具有一定作用。Hsieh[12]等发现人参皂苷Rh2具有抗炎及抗氧化作用，对肺疾病的前期阶段有潜在治疗作用。GRh2降低了由LPS诱导的促炎介质一氧化氮(NO)、TNF‐α、白细胞介素(IL)-1β和抗炎细胞因子(IL-4、IL-6和IL-10)在肺组织中的生成。提出其机制是GRh2阻断了iNOS、COX-2、IκB-α磷酸化、ERK、JNK、p38、Raf-1和MEK蛋白的表达。人参皂苷Rb1通过调节小鼠肺部的Nrf2和线粒体信号通路（如CASP3等）来减轻急性肺损伤的炎症反应及氧化损伤[13]。Wang等研究表明，人参皂苷Rg3对氧化乐果诱导的大鼠肺损伤具有保护作用，其机制与其抗氧化作用和抗炎作用有关，Rg3使丙二醛、TNF-α含量和髓过氧化物酶活性显著降低[14]。人参皂苷Rg2和Rh1可显著降低促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IFN-β的mRNA水平[15]。Rgx365（Rg2、Rg4、Rg6、Rh1和Rh4）通过抑制p-STAT-1和NF-κB调节iNOS，具有重要的抗炎作用，可能适合于炎症性疾病的治疗[16]。由此，人参、红参、黑参治疗慢性支气管炎主要发挥了抗炎、抗氧化等方面的作用从而体现出抗肺气虚的功效。

且以上成分中如人参皂苷Rh4、Rg5、Rg3、Rk3、Rk1等为人参稀有皂苷，其是黑参中的主要成分，含量及活性均远胜于红参与人参，由此推测黑参对于慢性支气管炎的治疗作用较红参与人参强，更有利于缓解肺气虚。

由PPI网络筛选所得到的主要作用靶点（Degree＞15）包括信号传导和转录激活因子（STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK14、MAPK8、MAPK1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、B细胞淋巴瘤2(BCL2L1)、胱天蛋白酶(CASP3、CASP8)、雷帕霉素靶蛋白(MTOR)、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、基质金属蛋白酶（MMP9、MMP2）等。近年研究发现，STAT3可被各种细胞因子激活，是参与调控肿瘤细胞生长、凋亡以及一系列炎症反应的重要信号交汇点，具有复杂的生物调节作用[17]；VEGFA是血管生长的主要调节因子，体内血管生成可以简单地看作是五种主要反应:增殖和存活、细胞迁移、血管通透性、侵袭周围组织和内皮细胞炎症[18]。有体内实验表明，与模型组比较，平喘颗粒能够显著抑制哮喘气道炎症、胶原沉积和VEGFA蛋白的表达[19]；AKT(也称为PKB)是PI3K下游的一个信号中间体，分为1-3三种亚型，在VEGF调控的内皮细胞生物学中具有相当重要的作用。AKT的活性还与基质金属蛋白酶(MMPs)的合成和释放有关，使内皮细胞呈现出炎症特性。AKT的下游靶点包括:B细胞淋巴瘤2(BCL2L1)的相关死亡启动因子；NF-κB抑制剂激酶(IKK)复合物，它调节核因子NFκB，从而促进炎症信号的释放;雷帕霉素复合物的机制靶点(MTORC1)，增加蛋白质合成[18]。MAPK信号通路的主要组成部分p38MAPK，ERK1/2和JNK均会参与炎症反应的表达[20]。基质金属蛋白酶9（MMP-9）目前已作为COPD稳定期的可靠生化检测指标，期间它的分泌量增加，会破坏肺泡基质、气道的重塑[21]。综上，STAT3，VEGFA，MAPK等信号因子与CB相关炎症发病机制有着紧密联系。

GO功能富集分析得到人参治疗CB可能与磷酸酶结合、半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、肽链内切酶活性、MAP激酶活性等生物过程有关；红参治疗CB可能与磷酸酶结合、蛋白酪氨酸激酶活性、泛素蛋白连接酶结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、细胞因子受体结合等生物过程有关；黑参治疗CB可能与跨膜受体蛋白激酶活性、SH2域结合、生长因子结合、蛋白质磷酸化氨基酸结合、血小板衍生生长因子受体结合等生物过程有关。

由KEGG富集分析所得到的三种药物治疗CB重合度较高的生物学通路主要包括：PI3K-Akt信号通路、松弛素信号通路、Th17细胞分化、IL-17信号通路、MAPK信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路、肿瘤坏死因子TNF信号通路、EB病毒感染、人类巨细胞病毒感染等。查阅文献得知，炎症反应是CB的核心机制，又细分为氧化应激、粘液高分泌、气道表面脱水及气道重塑几方面。PI3K/Akt信号通路能够参与外部刺激反应的重要细胞级联，并在多种生物过程如炎症反应、细胞凋亡及增殖等中发挥重要作用。而通过阻断PI3K/Akt信号通路，能够减少炎性细胞(如嗜酸粒细胞，中性粒细胞)在肺组织的浸润，从而抑制气道炎症及杯状细胞增生引起的黏液高分泌[22]。在抗炎方面，松弛素可以抑制中性粒细胞对内皮细胞的粘附性以及对巨噬细胞的浸润，可以抑制NLRP3和NFκB信号通路，减少炎症反应，并降低炎症因子的释放，如IL-1β，IL-6和TNF-α[23]。IL-17被认为主要由辅助性T细胞17(Th17)产生，IL-17作为促炎细胞因子，可诱导间充质细胞和骨髓细胞释放某些趋化因子、细胞因子、基质金属蛋白酶(MMPs)和抗菌肽。实验研究表明，IL-17与其受体结合，激活NF-κB、MAPK等下游通路，诱导IL-6、TNF-α等促炎细胞因子表达，诱导炎症发生[24]。研究表明，糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路中，AGE与RAGE的结合可显著提高TGF-β和MMP-9 mRNA，IL-1的表达水平，促进NF-κB的释放转运[25]。流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路中，激活的膜上受体TNFR1、IL-1R间接作用于TAK1，TAK1诱导IKK磷酸化，磷酸化后的IKK在胞质中引起I-κB水解，释放出NFκB，被激活的NF-κB进入细胞核，诱导炎症介质基因表达：如iNOS、ICAM1、TNF-α等[26]。以上均提示人参、红参、黑参主要通过调节PI3K-Akt信号通路、松弛素信号通路、Th17细胞分化、IL-17信号通路等治疗慢性支气管炎，一定程度上阐述了三参抗肺气虚的作用机制。

综上所述，本文初步阐释了人参、红参及黑参干预慢性支气管炎的作用机制及物质基础，体现了多成分、多靶点、多通路的显著特点，其中黑参的治疗作用较强，为进一步研究肺气虚的临床证候提供了理论依据。