基于转录组分析ABA促进葡萄花青苷积累相关基因

徐献斌，耿晓月，李慧，孙丽娟，郑焕，陶建敏

基于转录组分析ABA促进葡萄花青苷积累相关基因

徐献斌，耿晓月，李慧，孙丽娟，郑焕，陶建敏

南京农业大学园艺学院，南京 210095

【】分析参与调控ABA促进葡萄着色的相关基因，探讨ABA促进葡萄果实花青苷积累的分子机制。以‘红巴拉多’葡萄为试材,在转色前期（约花后6周）使用300 mg∙L-1ABA对果穗进行浸果处理，以清水处理为对照。观察表型，并利用超高液相色谱质谱联用仪（UPLC-MS）测定花青苷组分及含量，再利用转录组测序技术从分子水平对ABA促进花青苷积累的机制进行生物信息学分析。外源ABA处理3 d后，葡萄果实着色明显加深，花青苷种类和含量增多，其中芍药素3-O-葡萄糖苷、锦葵色素3-O-葡萄糖苷两种单体花青苷含量增加最为显著。分析ABA处理18 h和3 d后葡萄果实转录水平的差异，并通过KEGG富集分析发现了11个ABA信号通路基因以及52个与花青苷生物合成和转运相关的基因差异表达，它们均在外源ABA处理后表达上调。通过将差异基因与葡萄转录因子库进行比对，共发现297个转录因子差异表达。进一步分析差异转录因子表达模式，筛选与表达模式相近的转录因子，发现15个MYB、bHLH、bZIP、NAC、Dof、HD-ZIP等家族的转录因子，其可能参与调控花青苷生物合成。启动子顺式作用元件分析表明，大部分筛选到的差异基因启动子中含有ABRE元件，说明这些差异表达基因的启动子可能为ABA诱导型启动子。对部分候选基因的表达模式进行实时荧光定量（qRT-PCR）分析,证实了RNA-seq的准确性。ABA促进葡萄花青苷积累涉及11个ABA信号转导、52个花青苷合成和转运相关基因，15个转录因子可能参与调控了这一生物过程。研究结果为揭示ABA促进葡萄花青苷积累的分子机制提供了一定基础。

葡萄；花青苷；ABA；转录组；启动子

0 引言

【研究意义】葡萄（L）是一种全球广泛栽培的水果作物，可用于鲜食、酿酒、加工、制汁等，其中鲜食葡萄占有较大比重（约30%）[1]。在我国南方地区避雨栽培模式下，一些红色或黑色品种的葡萄果实，常常因为温度高或光照不足难以着色。果实颜色是衡量鲜食葡萄商业价值的重要指标，成熟期的果实着色不佳严重影响葡萄的经济价值。在许多鲜食葡萄品种中，外源使用ABA能有效促进葡萄果实着色已得到证实，但其潜在的分子机理尚不清楚[2-4]。因此，探究ABA促进葡萄果实着色分子机制，可为生产上外源使用ABA提供理论基础。【前人研究进展】前人研究表明，ABA是调控非呼吸跃变型果实成熟的重要激素，内源ABA含量在果实始熟期开始快速上升，在果实糖分积累、软化、着色等过程中起着关键作用[5]。研究表明，外源ABA处理使葡萄提早成熟，显著促进葡萄的着色，且不会明显影响可溶性固形物、可滴定酸等果实品质[3-4,6]。也有学者认为，外源ABA不仅可以促进葡萄果实着色，同时可以提高葡萄的内在品质[7-8]。ABA对葡萄果实品质产生不同影响的原因可能是外源ABA的浓度、施用方式以及葡萄品种的不同。但可以证实的是，ABA能促进葡萄果实着色，提高果实的外观品质。在生理水平上，研究者们对外源ABA促进葡萄着色的机理开展了一些研究。外源ABA处理后，果实内源ABA含量提高，内源乙烯合成增加，改变了ABA、乙烯、吲哚乙酸、赤霉素、玉米素核苷等之间的动态平衡关系，从而促进果实花青苷合成和果实着色[9]。在分子水平上，有一些研究从基因角度探究ABA促进葡萄着色的机理。外源ABA通过上调、、、、、、等类黄酮通路结构基因和、等转录因子的表达水平，促进花青苷的生物合成[10-11]。Gao等[12]证实了ABA受体基因在‘巨峰’葡萄中瞬时过表达可以促进花青苷积累。【本研究切入点】尽管前人对ABA促进葡萄果皮花青苷积累方面进行了大量研究，但ABA促进花青苷生物合成是一个涉及许多基因的复杂过程，其相关的分子机制仍不明确。通过传统分子生物学方法逐一地对这一生物合成过程涉及的大量基因进行研究，不仅效率低，而且难度大。利用高通量转录组测序（RNA-Seq）能够全面、快速地分析ABA促进花青苷合成相关的基因网络变化。【拟解决的关键问题】本研究以‘红巴拉多’葡萄为试材,在转色前期使用ABA处理，选取关键时期进行转录组测序。深入研究与花青苷合成和转运相关基因在ABA处理后的表达模式，并且筛选可能参与调控ABA促进花青苷积累的关键转录因子，以全面地了解ABA促进葡萄花青苷合成的基因调控网络和表达模式，为ABA促进花青苷积累的分子机制研究奠定基础，同时为生产上外源使用ABA促进葡萄着色提供理论依据。

1 材料与方法

试验于2019年在南京农业大学汤山葡萄基地进行。

1.1 试验材料

选用‘红巴拉多’葡萄为试验材料，选择树体长势一致的植株，树形为平棚架型，栽培管理等同常规。

果实的转色前期（花后第6周），在预试验基础上选用300 mg∙L-1ABA（上海源叶）对‘红巴拉多’葡萄果穗进行浸果处理，以清水处理为对照。处理后24 h内每隔6 h取样一次，处理后3 d（出现明显表型差异）取样一次。将所取样品用手术刀片剥取果皮，液氮速冻后-80℃保存备用。

1.2 花青苷的提取及定性分析

总花青苷的提取参照Jia等[13]的方法并加以改进。取待测定的葡萄果皮样品，用液氮研磨成粉末，称取1.0 g样品粉末，加入10 mL含1%盐酸的甲醇溶液，4℃黑暗条件下静置24 h，10 000 r/min高速离心10 min，沉淀反复浸提两次，合并上清液，用0.22 μm滤膜过滤后合并上清液待测。

使用AB SCIEX Triple TOF 5600+液质联用仪测定花青苷的组分及相对含量，参照Zhang等[14]的方法并加以改进。流动相A泵溶液：0.1%甲酸水溶液；B泵溶液：0.1%乙腈。洗脱条件：流动相洗脱梯度：0—0.5 min，5% B；0.5—20.5 min，5%—40% B；0.5—22.5 min，40%—95% B。流速：0.2 mL∙min-1。进样量：2 μL。

质谱条件：使用正离子模式下的电喷雾源和质谱采集模式，选择的质量范围为50—1 200 m/z。使用亮氨酸脑啡肽（m/z 556.2771）重新校准，启用锁定质量选项。电离参数为：毛细管电压3.0 kV，锥电压40 V，源温度120℃、脱溶气体温度为400℃。

采用外标法对花青苷组分进行相对定量：配制0.02—20 ng·mL-1不同浓度的锦葵色素-3-O-葡萄糖苷标准品溶液绘制标准曲线，相关系数为0.9986，回归方程为=1E+06-245385。

1.3 ABA含量测定

ABA的提取和测定参照Hu等[15]的方法并加以改进。取待测定的葡萄果皮样品，用液氮研磨成粉末，称取1.0 g样品粉末，加入10 mL含80%的甲醇溶液，4℃黑暗条件下静置12 h，10 000 r/min高速离心10 min，沉淀反复浸提两次，合并上清液，加入0.2 g PVPP，在4℃恒温摇床中120 r/min振荡1 h,离心后取上清液过C18小柱，使用冷冻干燥器冻干48 h，再加入1 mL 80%的甲醇溶解，用0.45 μm滤膜过滤后合并上清液待测。

HPLC条件：所用仪器为3200 Qtrap高效液相色谱-串联三重四级杆质谱联用仪（AB SCIEX），色谱柱：phenomenex Kinetex® XB-C18（100 mm×3 mm，2.6 μm）；流动相：A泵溶液：0.1%甲酸水溶液，B泵溶液：甲醇。洗脱条件：0—1 min，5% B；1—4 min，5% B—95% B；4—8 min，95% B；8—8.1 min，95% B—5% B。流速：0.3 mL· min-1；柱温：40℃；进样量：10 μL。

质谱条件：在MRM模式下，用电喷雾电离ESI负离子模式，离子源：Turbo Spray，气帘气CUR：25，离子源喷雾电压IS：-4 500 kV，温度TEM：500℃，喷雾气GS1：45，辅助加热气GS2：30，碰撞气CAD：Medium，入口电压EP：-10 V，碰撞单元出口电位CEP：-18.37，出口电压CXP：-2.2 V。

精确配制5—1 000 ng·mL-1不同浓度的ABA标准品溶液绘制标准曲线，相关系数为0.99913，回归方程为=127.22+145.81。

1.4 总RNA提取、cDNA文库建立及测序

总RNA的提取采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN，China），所有操作按照说明书进行。取2 μL RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，检测RNA样品的质量。用Nanodrop ND-1000超微量分光光度计检测RNA浓度。

使用NEBNext® UltraTMRNA文库制备试剂盒（NEB，USA）建立测序文库。使用Qubit 2.0荧光仪和Agilent 2100生物分析仪检查cDNA文库质量。检测合格的cDNA文库在Illumina Hiseq平台上测序。每个样品进行3次生物学重复。将原始数据进行过滤，去除接头污染、未知碱基N含量过高和低质量序列后，获得高质量的序列数据（clean reads）。

1.5 葡萄参考基因组比对及基因功能注释

利用HISAT2将clean reads与葡萄参考基因组（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/003/745/GCF_000003745.3_12X/GCF_000201 003745.3_12X_genomic.fna.gz）进行比对。计算每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments（FPKM值），用RSEM工具检测基因和转录表达水平，用DEseq2检测差异表达基因（DEGs）。筛选差异基因的错误发现率（FDR）阈值设为≤0.05。差异基因基于NCBI非冗余蛋白序列数据库（Nr，http://ftpprivate.ncbi.nlm.nih.gov）、Gene Ontology数据库（GO，http://www.geneology. org/）、KEGG Ortholog数据库（KEGG，http://www. genome.jp/kegg/）进行基因功能注释。

1.6 差异表达基因富集分析

根据Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）的注释结果和官方分类，分别对差异基因的功能和生物学途径进行分类。用Blast2Go进行GO富集分析，-value（adj）≤0.05。采用两种统计检验（hypergeometric Fisher’s exact test，＜0.01）进行统计分析，以确定KEGG途径在统计学上的显著富集。

1.7 转录因子(TF)分析及启动子顺式作用元件分析

将差异基因与葡萄转录因子数据库（http://planttfdb. cbi.pku.edu.cn/index.php?sp=Vvi）进行比对，获取差异表达的转录因子以进行进一步筛选。

利用TBtools（http://www.tbtools.com/）软件和葡萄全基因组序列提取候选差异基因上游2 kb启动子序列，上传到plantcare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/）网站进行顺式作用元件分析。

1.8 qRT-PCR分析

qRT-PCR引物使用Beacon Designer 7.0软件（Premier Biosoft Internaition，USA）设计，引物见表1。所有引物均用PCR扩增、电泳和溶解曲线进行测试以保证引物特异性。使用ABI-7300系统进行qRT-PCR，反应体系按SYBR Green PCR Master Mix（Takara）试剂盒说明书进行。以为内参，用2-ΔΔCT公式计算相对表达量[16]。

表1 荧光定量PCR引物设计序列

2 结果

2.1 ABA处理后‘红巴拉多’葡萄果皮花青苷含量和组分分析

如图1所示，外源ABA处理3 d后，‘红巴拉多’葡萄外观出现了明显的变化，果皮呈现红色。UPLC-MS结果显示，与对照组相比，ABA处理组葡萄果皮的总花青苷含量约为对照的9倍，表明ABA处理显著提高了葡萄的总花青苷含量。对照组葡萄果皮中只有飞燕草素3-O-（6''-p-香豆酰葡萄糖苷）、芍药素3-O-葡萄糖苷、锦葵色素3-O-葡萄糖苷3种花青苷，且含量很低。与对照组相比，ABA处理组增加了3种花青苷，分别是矮牵牛素3-O-葡萄糖苷、天竺葵素3-O-（6''-p-香豆酰葡萄糖苷）、芍药素3-O-（6''-p-香豆酰葡萄糖苷），但含量并不高。但ABA处理显著增加了芍药素3-O-葡萄糖苷、锦葵色素3-O-葡萄糖苷的含量，ABA处理组的含量分别约为对照组的12倍和9倍（表2）。

图1 外源ABA处理3 d后‘红巴拉多’葡萄表型

2.2 VvNCED1表达模式分析及内源ABA含量测定

qRT-PCR结果显示，ABA处理后24 h内的表达随着处理时间表现出先升后降的变化趋势；其在处理后18 h达到峰值，随后逐渐下降（图2）。此外，ABA处理后相对表达水平显著高于对照，说明葡萄果皮中受到ABA的诱导迅速上调表达（图2）。

表2 外源ABA处理对‘红巴拉多’葡萄果皮花青苷含量和组分的影响

**表示差异极显著（＜0.01）

** indicate extremely significant difference (＜0.01)

对葡萄果皮ABA含量进行HPLC-MS分析，结果表明ABA处理显著提高了果皮中ABA含量。在处理后18 h，ABA处理组果皮ABA含量约为对照组的1.7倍，而在处理后3 d则为对照的6.2倍（图3）。

*和**分别表示同期处理与对照在0.05和0.01水平存在显著性差异。下同

图3 葡萄果皮ABA含量

2.3 转录组数据分析

利用Illumina HiSeq高通量测序平台对已构建好的12个cDNA文库进行测序,得到4 135.2—4 852.8万条不同数目的原始序列。数据过滤后得到4 005.4— 4 733.7万条有效序列，有效比例96.19%—97.87%。与葡萄参考基因组比对后得到3 578.7万—4 225.3万条匹配的序列，比对率为94.3%—95.33%。通常质量控制参数Q30＞80%表示转录组测序质量可靠,本试验中Q30＞94.3%表明测序数据质量很高,可用于ABA处理后葡萄果皮差异表达基因的挖掘及对ABA促进葡萄果实着色机制的探讨（表3）。

表3 转录测序数据结果统计

将处理后18 h和处理后3 d两个时期的ABA处理组和对照组转录组数据进行比对分析，分别获得5 439和2 717个差异表达基因。在处理后18 h，共计2 897个基因表达上调，2 542个基因表达下调；在处理后3 d，共计1 336个基因表达上调，1 381个基因表达下调（图4）。

2.4 KEGG富集分析

为了进一步分析预测差异基因的生物功能，对ABA 18 h vs CK 18 h和ABA 3 d vs CK 3 d两组差异基因进行了KEGG富集分析，分别有2 529个差异基因富集到118个通路、1 335个差异基因富集到113个通路上。如图5所示，黄酮和黄酮醇生物合成、类黄酮生物合成以及植物信号转导在两组差异基因的KEGG分析中显著富集。

图4 不同时期的差异表达基因

2.5 ABA信号通路差异表达基因分析

差异表达基因在KEGG Pathway数据库中注释分析，获得植物信号转导途径（KEGGID：vvi04075）中ABA信号通路的差异基因。11个差异表达基因中有1个基因被注释为ABA受体（PYL/PYR），5个被注释为2C型蛋白磷酸酶（PP2C）、3个基因被注释为SnRK2激酶、2个基因被注释为ABRE元件结合因子（AREB/ABFs）。通过绘制热图对差异表达基因在两个时期的表达水平进一步分析（图6），结果显示，ABA受体基因表达水平在ABA处理后18 h上调，在ABA处理后3 d下调。除外的其他10个ABA信号通路基因表现出相似的表达模式，与对照相比，差异基因的表达水平在ABA处理后18 h和3 d均上调。与ABA处理3 d后相比，ABA处理18 h后，表达水平较高，表达水平较低。

图5 差异基因KEGG富集分析气泡图

颜色代表相应的FPKM数值，数值越大，颜色越红；从左到右样本依次为CK-18 h、ABA-18 h、ABA-3 d、CK-3 d、ABA-3 d。下同

2.6 花青苷合成和转运相关基因的表达

差异表达基因在KEGG Pathway数据库中注释分析，获得类黄酮生物合成途径（KEGGID：vvi00941）的差异基因。5个基因被注释为苯丙氨酸氨基裂解酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL），2个基因被注释为肉桂酸4-羟化酶（cinnamate-4- hydroxylase，C4H），2个基因被注释为4-香豆酰CoA连接酶（4-coumaroyl-CoA synthase，4CL），8个基因被注释为查尔酮合酶（chalcone synthase，CHS），2个基因被注释为查尔酮异构酶（chalcone isomerase，CHI），1个基因被注释为类黄酮3′-羟化酶（flavonoid- 3′-hydroxylase，F3′H），5个基因被注释为F3′5′H，2个基因被注释为黄烷酮3-羟化酶（flavanone-3- hydroxylase，F3H），1个基因被注释为黄烷酮醇4-还原酶（dihydroflavonol-4-reductase，DFR），1个基因被注释为无色花色素双加氧酶，6个基因被注释为UDP葡萄糖-类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶（flavonoid glucosyltransferase，UFGT）。

根据基因功能注释，在差异基因列表中查找与花青苷修饰和转运相关的差异表达基因。差异基因中有6个基因与花青苷修饰有关，5个被注释为O-甲基转移酶（O-methyltransferase，OMT）和1个花青苷酰基转移酶（anthocyanin acyltransferases，AAT）。此外，有11个差异基因与花青苷转运相关，其中有6个被注释为谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferase，GST）、1个被注释为ATP结合盒亚族C（ATP binding cassette C family，ABCC）、4个被注释为多药和有毒化合物排出家族（multidrug and toxic compound extrusion，MATE）。

对花青苷生物合成结构基因、修饰和转运相关基因的表达模式进行分析（图7），52个差异基因均在ABA处理后表达水平上调。与ABA处理18 h后相比，18个差异基因在ABA处理3 d后表达水平较低，34个差异基因表达水平较高。值得注意的是，2个均在ABA处理18 h后表达水平最高，5个中有4个也在ABA处理18 h后表达水平最高。

图7 花青苷积累相关基因表达模式分析

2.7 花青苷生物合成相关转录因子的筛选

基于转录组测序数据中差异表达的转录因子，参考北京大学植物转录因子数据库PlantTFDB（http:// planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）公布的葡萄转录因子家族序列信息，共获得296个差异转录因子。如图8所示，对差异表达转录因子进行划分，共分为40个转录因子家族。含有转录因子最多的3个家族是MYB家族、ERF家族、NAC家族，分别含有28、23、23个转录因子。其他含有转录因子较多的是WRKY、bHLH、bZIP家族，分别有21、20、17个转录因子。

对所有差异表达的转录因子进行表达模式分析（图8），并筛选与表达模式相似的转录因子。共得到14个可能与花青苷生物合成相关的转录因子，主要有MYB家族的转录因子。也有少量的bZIP、bHLH、NAC、Dof、HD-ZIP转录因子，这些转录因子涉及花青苷生物合成、ABA信号转导、抗逆胁迫、果实成熟等多个生物代谢途径。

2.8 差异基因启动子序列ABRE元件统计

候选差异基因启动子中ABA响应元件（ABRE）数量统计结果显示（表4），60个差异基因的启动子序列中含有ABRE元件，有50个启动子中含有多个ABRE元件。类黄酮生物合成途径中的32个差异基因启动子序列中含有ABRE元件，只有（LOC100232999）、（LOC100232843、LOC100241164）、（LOC100264341）4个基因的启动子序列中不含有ABRE元件。与花青苷修饰相关的7个差异基因中，只有（LOC100251744）的启动子序列不含ABRE元件。与花青苷转运相关的11个差异基因中，只有3个（LOC100242506、LOC100232976、LOC100233043）的启动子序列中不含ABRE元件。15个可能参与调控花青苷生物合成的转录因子的启动子序列中均含有ABRE元件。值得注意的是，与花青苷转运相关的启动子中含有11个ABRE元件，调控花青苷生物合成的转录因子启动子中含有13个ABRE元件。

图8 差异基因转录因子分析

表4 差异基因2000 bp启动子序列中ABRE作用元件数量统计

续表4 Continued table 4

2.9 差异表达基因的qRT-PCR验证

选取6个花青苷生物合成相关基因、2个花青苷转运相关基因和4个差异表达转录因子进行qRT-PCR分析。如图9所示，12个差异表达基因均在ABA处理后表达上调，其中、、、-处理后18 h相对表达水平最高，、、、、、、、均在处理后3 d相对表达水平最高。以上qRT-PCR结果均与转录组测序结果相符，说明转录组测序数据准确可靠。

图9 差异表达基因qRT-PCR验证

3 讨论

3.1 外源ABA处理对葡萄果皮花青苷合成的影响

前人研究表明，花青苷的含量和组分决定了葡萄着色的类型[17]。外源ABA能促进葡萄果皮中总花青苷和花青苷单体的含量[10,18]。本研究中，外源ABA处理3 d后‘红巴拉多’葡萄果实明显呈现红色，而清水处理的葡萄仍为绿色（图1）。外源ABA处理增加了葡萄果皮花青苷的种类和含量，但增加的矮牵牛素3-O-葡萄糖苷、天竺葵素3-O-（6''-p-香豆酰葡萄糖苷）、芍药素3-O-（6''-p-香豆酰葡萄糖苷）含量很低，因此，花青苷种类的增加可能不是葡萄迅速着色的原因。外源ABA处理后，葡萄果皮中芍药素3-O-葡萄糖苷、锦葵色素3-O-葡萄糖苷两种单体花青苷含量的显著提高可能促进了葡萄着色。

3.2 外源ABA处理对葡萄果实内源ABA合成的影响

ABA是调控葡萄成熟的关键内源激素，其含量的变化与果实成熟进程高度相关[19]。9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）是植物体内ABA生物合成的关键限速酶[20]。在葡萄果实始熟期启动ABA的合成，在果实成熟过程中起着关键调控作用[21]。研究表明，外源ABA处理葡萄果实后表达迅速上调，同时内源ABA含量增加。本试验qRT-PCR结果也显示，外源ABA处理显著上调了的表达，且在处理后18 h达到峰值。HPLC-MS分析发现，ABA处理后18 h和处理后3 d，内源ABA含量均显著增加。外源ABA可能通过激活的转录，启动了葡萄果实中内源ABA的合成，从而促进了葡萄果实的花青苷积累和着色。

3.3 ABA信号通路中的差异表达基因

ABA信号通路由ABA受体（PYL/RCAR）、2C型蛋白磷酸酶（PP2C）、SnRK2激酶、ABRE元件结合因子（AREB/ABFs）组成[22]。葡萄基因组中鉴定和分离出了7个ABA受体基因，这些基因受不同非生物胁迫因子的调控[23]。研究表明参与调控葡萄果实花青苷的生物合成[12]。本研究中在ABA处理后18 h表达上调，说明可能在ABA诱导的花青苷积累中发挥调控作用，这与前人研究报道一致。葡萄中有两个AREB/ABFs类基因，被命名为和[24]。其在荔枝中的同源基因s也被证明参与调控荔枝果皮花青苷生物合成过程[15]。转录组数据显示，和在ABA处理后两个时期的转录水平均上调，可能其在调控花青苷生物合成方面与作用相似。共有11个ABA信号通路基因在ABA处理后表达上调，说明葡萄果实ABA信号转导在花青苷合成中可能具有重要作用。

3.4 花青苷生物合成、转运相关差异表达基因

葡萄果皮中花青苷的生物合成主要通过类黄酮通路进行，这个过程由结构基因所控制，调节下游各个结构酶形成多酶复合物，进而催化花青苷生物合成[25]。本研究有35个差异基因富集到类黄酮通路中，包括、、、、、、、、、、等11个结构基因。ABA处理后这些结构基因表达上调，类黄酮通路合成增加，催化了花青苷的合成。O-甲基转移酶（OMT）和花青苷酰基转移酶（AAT）可将花青素进行修饰，使其更稳定和多样化[26-27]。差异基因中的5个和1个也在ABA处理后表达水平增加，表明ABA处理后花青苷修饰过程活跃。谷胱甘肽转移酶（GST）、ATP 结合盒亚族C（ABCC）、多药和有毒化合物排出家族（MATE）基因是将花青苷从细胞质转移到液泡中的关键基因[28-30]。11个花青苷转运相关基因上调，说明ABA处理后花青苷转运过程增强。本研究发现，ABA对葡萄花青苷的影响是一个复杂的过程，涉及合成、修饰、转运等多个过程。

3.5 可能调控花青苷生物合成的转录因子

花青苷生物合成涉及许多转录因子的调控，是调控葡萄花青苷生物合成重要的转录因子在自身启动子的作用下遗传转化白皮品种‘霞多丽’葡萄植株，转基因葡萄果皮变红，在35S启动子的作用下过表达，转基因植株的果皮果肉均积累花青苷呈现黑紫色；而在黑皮品种‘西拉’葡萄中沉默后，转基因植株果皮花青苷积累很少或不积累，呈现红皮或者白皮的表型[31]。有研究表明通过激活、的启动子来调节其表达，从而调控花色苷的合成积累[32]。功能相似或参与同一生物合成过程的转录因子往往表现出相似的表达模式，因此与表达模式相近的转录因子可能与花青苷生物合成有关。本研究筛选得到的15个转录因子中，6个转录因子已被证明参与调控花青苷生物合成。、和在葡萄2号染色体上形成基因簇，和决定了葡萄是否着色以及着色类型[33]。有研究表明MYB家族成员可能正调控类黄酮的合成[34]。属于bHLH类转录因子，研究证实、、、和相互作用参与调控类黄酮途径[35]。转录抑制因子和负调控花青苷生物合成过程。转录抑制因子通过与bHLH结合或抑制和的表达负调控花青苷的合成[36]。R2R3转录抑制因子在烟草中过表达引起花的色素积累减少，在拟南芥中过表达下调了花青苷生物合成结构基因、、的表达水平[37]。负调控花青苷生物合成的和表达水平上调，这可能是一种花青苷合成的反馈调节机制。研究表明，在花青苷积累过程中，R2R3-MYB转录激活子可能会上调R2R3-MYB转录抑制子的表达，从而提供反馈抑制使花青苷处于适当的水平[38-40]。此外，还有8个差异表达的转录因子可能参与调控花青苷生物合成，其中包括2个MYB（，LOC10050942；，LOC100260647）、1个NAC（，LOC104879728）、3个bZIP（，LOC100243434；，LOC100232889；，LOC100258873）、1个Dof（，LOC100265549）、1个HD-ZIP（，LOC100245524）。这些转录因子均在ABA处理后表达上调，在花青苷生物合成过程中的调控作用尚需进一步验证。

3.6 差异表达基因启动子的ABRE元件分析

启动子是控制基因表达的重要转录调节因子，分析启动子序列中的顺式作用元件是了解基因转录调控表达模式及调控机制的关键[41-42]。ABRE元件是一种含有G-box的保守顺式作用元件，一般存在于ABA所调控基因的启动子中，ABA通过启动子区域的ABRE元件激活下游基因的表达[43]。为了研究ABA对差异表达基因的调控作用，对差异基因启动子进行提取和顺式作用元件分析。60个候选差异基因的启动子中含有ABRE元件，这些启动子可能是ABA诱导型启动子，可在ABA信号的刺激下快速调整转录活性，从而调控基因的转录水平。在先前的多个研究中，受到ABA的诱导而显著上调表达[44-45]。本研究发现启动子序列中含有13个ABRE元件，说明可能是ABA直接调控的基因，这与前人研究相符。大多数与花青苷合成、修饰、转运相关的基因以及相关转录因子，启动子序列中含有ABRE元件，说明它们可能是ABA诱导型基因。由此推测，与葡萄花青苷积累相关基因在ABA处理后转录水平上调，可能与启动子中ABRE元件的转录激活效应有关。外源ABA处理后，葡萄果实内源ABA水平提高，ABA信号转导活跃，激活了下游一系列与花青苷积累相关基因的转录，从而使花青苷合成和转运增强，在果皮中积累而使葡萄着色。ABA信号通路中两个ABF转录因子对花青苷合成的调控作用，有待通过基因过表达技术和基因沉默技术进一步证实，其是否能够作用于含有ABRE元件的花青苷生物合成相关基因的启动子序列，尚需酵母单杂交、双荧光素酶报告基因等相关试验进行验证。

4 结论

ABA处理促进葡萄果实着色明显加深和花青苷积累，涉及11个ABA信号转导、52个花青苷合成和转运相关基因，15个MYB、bHLH、bZIP、NAC、Dof、HD-ZIP等家族的转录因子可能参与调控花青苷的生物合成。大部分筛选到的差异基因启动子中含有ABRE元件，这些差异表达基因的启动子可能为ABA诱导型启动子。

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Transcriptome Analysis of Genes Involved in ABA-Induced Anthocyanin Accumulation in Grape

XU XianBin, GENG XiaoYue, LI Hui, SUN LiJuan, ZHENG Huan, TAO JianMin

College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095

【】The aim of this study was to analyze the genes involved in the regulation of ABA induced grape coloring, and to explore the molecular mechanism of ABA induced anthocyanin accumulation in grape. 【】In present study, Benibalado was used as the experimental material. In the early stage of veraison, the grape clusters were treated with 300 mg·L-1ABA, water treated as control. The grape phenotypes were observed and anthocyanins were determined by UPLC-MS. The mechanism of ABA promoting anthocyanin accumulation was analyzed by transcriptome sequencing. 【】After 3 days of exogenous ABA treatment, the grape berries were obviously colored, and the variety and content of anthocyanins were also increased. Among them, Peonidin 3-O-glucoside and Malvidin 3-O-glucoside increased most significantly. By KEGG enrichment analysis, 11 DEGs related to ABA signaling and 52 DEGs that related to anthocyanin biosynthesis, and transportation were identified, all of which were up-regulated. After exogenous ABA treatment, the DEGs from RNA-seq were searched by using BLAST against the grape TF database, and 297 transcription factors were identified. Through the further analyzing of the expression patterns of identified TFs, 15 members of MYB, bHLH, bZIP, NAC, Dof, and HD-ZIP families were observed to regulate anthocyanin biosynthesis. The analyzing of cis-acting elements in promoters showed that ABREs were identified in most of the promoters. The accuracy of RNA-seq was validated by qRT-PCR analysis of some candidate genes. 【】Overall, ABA promoting anthocyanin accumulation in grape was a complex process, including 11 DEGs related to ABA signal transduction, 52 DEGs that related to anthocyanin biosynthesis, modification and transportation, 15 transcription factors. This study provided a basis for revealing the molecular mechanism of ABA promoting anthocyanin accumulation in grape fruits.

grape; anthocyanin; ABA; RNA-seq; promoter

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.01.012

2021-03-15；

2021-06-08

国家现代农业葡萄产业技术体系（CARS-29）、国家自然科学基金（31901975，31972384）、江苏农业产业技术体系（JATS［2021］450）、江苏省农业重大新品种创制项目（PZCZ201723）、国家重点研发计划（2020YFD1000204）

徐献斌，E-mail：619262966@qq.com。通信作者陶建敏，E-mail：taojianmin@njau.edu.cn

（责任编辑 赵伶俐）