大脑类器官在胶质瘤治疗中的应用研究及展望

郝路 王之敏

摘要：胶质瘤是一种常见原发性神经系统肿瘤，具有高度异质性和很强的侵袭性，临床治疗存在很大挑战。当以往研究多以二维细胞培养和动物模型为研究对象，但存在很大缺陷。近年来，科学研究人员构建出一种与人体组织和器官的结构相似的三维结构，类器官，包胞分布和组织、生理结构、电活动和神经元网络，可模拟出肿瘤微环境，与实体肿瘤具有极高的形式度，有望成为胶质瘤研究的重要平台。本文对大脑类器官及其构建方法进行了简要介绍，并对其在胶质瘤研究中的应用进行了归纳。

关键词：胶质瘤、大脑类器官、药物筛选、个性化治疗、肿瘤微环境

【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2022）02-03

胶质瘤是较为常见的原发性脑肿瘤，其预后较差[1]。目前主要的治疗方法是手术切除及放化疗，但效果有限，因其在脑组织中生长迅速，对化疗有耐药性，并且具有高度的侵袭性，为临床治疗造成了极大困扰，且胶质瘤容易复发。因此，迫切需要一个研究胶质瘤细胞动力学的平台，以发现疾病的特点，开发更有效的治疗方法。虽然以往研究中的2D细胞模型和动物模型為我们的研究提供了很大的帮助，但它们也存在一定缺陷：缺少肿瘤微环境[2-3];长期培养遗传特征发生变异[4-6]，周期长、成本高等。近年来，科学研究人员构建出一种与人体组织和器官的结构相似的三维结构，类器官，可以概括人类器官一些关键特征，包括细胞分布和组织、生理结构、电活动和神经元网络[7]，这一模型的出现弥补了二维细胞培养及动物模型之间的缺陷，为研究肿瘤的发生发展提供了独特视角[8]。

当前的研究中，胶质瘤大脑类器官的形成主要有3种形式：（1）基因编辑大脑类器官诱导脑肿瘤形成，已有研究[9]表明可通过基因编辑技术，使抑癌基因功能丧失，在大脑类器官中诱导肿瘤的发生。（2）胶质瘤干细胞与大脑类器官共培养，患者来源的胶质瘤干细胞是肿瘤在体内生成、增殖和侵袭不可缺少的关键性因素[10-11]。（3）从胶质瘤组织或胶质瘤干细胞中获得胶质瘤类器官，这种保留了母体肿瘤的异质性、相对的三维空间组织。这些方法产生的脑类器官已成为探索胶质瘤发病机制的独特模式，为胶质瘤的相关研究提供了良好的平台[12]。

应用于药物筛选

胶质瘤诊断后生存期较短，急需建立有效的疾病模型和药物筛选平台。常规的细胞平台是2D模式，不能形成正常组织以及肿瘤组织所处的微环境，无法模拟细胞间的相互作用，因此大脑类器官有望成为极具价值的药物筛选工具[13-14]。动物模型方面，建立人小鼠胶质瘤移植模型耗时较长，且费用昂贵，一些人类治疗靶点与小鼠存在一定差异，因此，动物模型评价胶质瘤药物敏感性的实用性往往较低。胶质瘤诱导的胶质瘤类器官，特别是患者源性细胞产生的类器官，很好地克服了上述两大问题，为药物筛选提供了有效的平台。称为药筛平台主要得以于胶质瘤类器官具有三大突出优势：（1）首先是其快速生成性，在患者确诊后可在短时间内为临床治疗前提供检测药物反应;（2）对于培养的单一胶质瘤类器官中，更能表现出胶质瘤的异质性，往往比传统的胶质瘤模型更能表现出真实的药物反应;（3）具有更多的分子机制，包括基因表达类型、转录方式、不同活跃度的信号通路[15];（4）胶质瘤类器官具有多样性，并容易扩展，可为胶质瘤表型、基因型及细胞状态对药物反应的研究提供基础[16]。Amanda[17]等使用患者来源的胶质瘤干细胞（GSCs）和人类胚胎干细胞（hESC）构建大脑类器官，这一模型形成迅速，并由肿瘤微管网络相支持，有助于侵袭正常宿主组织;并用化疗药物和辐射对该模型进行处理，结果发现细胞活力显著下降，与2D细胞模型相比，其药物和辐射诱导所致的基因毒性应激具有更高的抵抗性，更能贴近体内检测结果，表明大脑类器官胶质瘤在体外药物筛选预测方面具有更高的潜能。Zhang等 [18]于2020年，报道了一个基于胶质瘤患者来源的组织和细胞的实时集成系统，通过生成三维体外大脑类器官和体内异种移植肿瘤，该系统有效地反应除了肿瘤的组织学特征，对化疗药物的反应，以及相应的母体肿瘤的临床进展;并运用该模型成功地识别了一例II级星形细胞瘤患者，在类器官和异种移植模型中均具有典型的IV级胶质瘤特征，模拟了该患者的疾病进展，我们开发了一个完整的平行模型系统，从患者来源的胶质瘤大脑类器官和异种移植来理解胶质瘤生物学和预测化疗药物的反应，为胶质瘤的治疗提供新的思路。

用于个性化治疗

胶质瘤大脑类器官还可用于患者的个性化治疗。因为随着用于的基因组测序技术的发展以及在科研、临床诊断中的应用，使得来源于患者的器官样培养物可进行实时基因测序，以揭示细胞对不同药物的反应[19]，因此有助于为患者提供针对性更强的个性化治疗方案。

Loong [20]等于2020年将靶向测序技术及患者源类器官培养技术相结合，为患者提供一套个性化治疗，为胶质瘤传统治疗方式提供了新的方向。胶质瘤干细胞从第一次手术患者的术中组织中提取，培养出胶质瘤类器官，然后对患者的器官进行靶向捕获测序技术，为后续的候选药物提供准确的信息。通过基因测序作者发现：在所有样本中均有两个NF1的移码突变，还有一份高度一致的拷贝数改变。在初级肿瘤中，杂合子PTEN拷贝丢失以及PTENW III+ 无义突变，提示PTEN功能双等位基因缺失，可能诱导mTOR信号通路。同时，在最初的临床表现中PIK3CAH1047Q突变的频率相对较低，但在复发时其突变频率变高，这表明了肿瘤自身的异质性。遗传异常表明了PI3K/ AKT/mTOR通路的激活。接下来，作者在培养的病人源性器官上测试了一组基因组介导的候选药物，以预测药物敏感性：作者发现病人的TMZ耐药性在胶质瘤大脑类器官中再次显示，因此他们对FDA批准的相关抗癌药物，如PTEN损失/PTENW III+药物mTOR抑制剂依维莫司和NF1移码突变的丝裂原活化蛋白激酶（MEK）抑制剂考比替尼。与其他药物相比，胶质瘤类器官对依维莫司的细胞毒性敏感性更高，因此选择依维莫司作为候选药物。患者最初每天服用依维莫司5mg，后来逐渐增加到每天10mg。治疗四周后复查影像学显示位于右侧脑室和第三脑室的残余肿瘤体积减小，肿块部分得到一定缓解，文章说明该肿瘤对PTEN通路的生长有很强的依赖性，因此可通过对这种依赖性的识别，为患者提供个性化治疗方案。研究揭示通过对胶质瘤患者类器官进行基因组测序以观察其基因突变情况，从而针对特定的基因突变进行相应的药敏实验，继而实现个性化治疗，这一操作在临床诊治中具有可行性。

上述个体化精准肿瘤数据的实质是通过基于测序，分析体患者肿瘤的基因组和识别出突变基因及突变位点，为个性化治疗提供依据。与传统的长期培养的肿瘤细胞系模型相比，胶质瘤类器官的优势在于能够更准确地总结疾病的分子特征和生物学特性。与PDX模型相比，胶质瘤类器官缩短了建模实验，也降低了模型成本[21-22]。更重要的是，使用胶质瘤类器官进行化学筛选具有显著的优势，因为它易于培养，研究材料丰富，这对产生可靠的药物反应参数是必要的。胶质瘤类器官代表了每个相应肿瘤的独特生物学特性，并为评价药物反应提供了更准确的模型系统。Jacob[23]等曾对胶质瘤类器官进行不同处理，药物处理包括替莫唑胺 、吉非替尼、曲米替尼、埃弗雷莫斯，以及辐射处理，结果发现，不同来源的胶质瘤类器官对不同方式治疗的反应存在很大的差异，其治疗效果与肿瘤的突变方式、类型以及通路富集具有很高的一致性，作者认为这一成果可揭示胶质瘤类器官在对个性化药物治疗的快速选择、功能测试具有重要意义。

免疫治疗模型

近年來，免疫治疗在临床应用中表现出了较好的临床效果，在肿瘤的治疗中表现出良好的潜力，已有部分研究发现了患者来源的胶质瘤大脑类器官可以用于模拟免疫治疗的效果。Jacob[23]等通过对GBO突变谱与对特定药物的反应相关联，并通过建模嵌合抗原受体T细胞免疫治疗来测试治疗效果，具体方法是将与EGFRvⅢ+肿瘤细胞有特意反应的CAR-T细胞与胶质母细胞瘤类器官共培养，结果揭示该胶质母细胞瘤类器官模型表现出了特有的细胞效应，即当CAR-T细胞增殖时，对表达EGFRvⅢ的细胞杀伤作用显著，使其数量减少，但不杀伤表达EGFR+EGFRvⅢ-的肿瘤细胞，反应出胶质母细胞瘤类器官在利用内源性靶点快速检测抗原特异性CAR-T细胞治疗效果方面的可用性。Neal等[24]将患者源的肿瘤类器官与含有内源性、同基因型的肿瘤浸润淋巴细胞共培养，发现淋巴拎包细胞保留了原有肿瘤T细胞受体谱，并保留了程序性细胞死亡因子1（PD-1）依赖的免疫检测点，阻断PD-1激活的抗原特异性肿瘤浸润淋巴细胞引发的肿瘤细胞毒性。PD-1是肿瘤细胞逃离机体免疫杀伤的重要免疫抑制靶点，与胶质瘤关系密切，该发现有望针对胶质瘤患者的康PD-1治疗得以进行体外测试，但作者并未进行该方向的深入研究。

构建患者来源的原位异种移植

患者来源的异种移植（PDXs）是一种成熟的临床前癌症模型，即在在免疫缺陷小鼠中植入患者肿瘤，进行研究。PDXs模型通常通过皮下或原位植入患者肿瘤组织碎片获得，但对于胶质瘤，建模成功率较低，仅为50%[25]。且将肿瘤碎片直接植入大脑在技术上难度极高，不易成功。患者来源的原位异种移植（PDOXs）建立在大脑植入神经胶质瘤技术的可行性和标准化，可避免神经胶质瘤的选择和适应，对于研究肿瘤的组织病理学特点和时间特异性意义重大。不同的胶质瘤类器官培养模式在异种脑移植时产生的肿瘤存在差异，有利于研究胶质瘤患者的组织病理学特征，如侵袭性、血管生成等。此外，研究人员已经证明DOXs可以在小鼠体内保持稳定几代。PDOXs的应用范围从体内药物验证研究、磁共振成像方案优化、利用同位素示踪剂动态分析体内肿瘤代谢、遗传和表型分析，到识别新的生物标志物和治疗靶点。因此，这种PDOXs模式为下游的研究提供丰富材料。

研究胶质瘤的发生发展

胶质瘤细胞的扩散侵袭性是其临床治疗的一大难点，其侵袭的作用机制尚不明确。胶质瘤细胞迁移侵袭的过程会表现出不同干细胞标志物的表达，可依据这一特点预测患者的治疗。建立一个胶质瘤细胞侵袭正常组织的体外模型可为这一研究提供良好的平台。Linkus 等将类器官与胶质瘤干细胞共培养，结果显示形成的胶质瘤细胞浸润脑组织的模式与胶质瘤患者手术发现的情况相似，不同患者来源的胶质瘤类器官增殖、迁移、侵袭模式不同。动物模型方面，da Silvia等[26]将取自患者的胶质瘤球体与小鼠胚胎干细胞来源的大脑类器官共培养，发现胶质瘤球体可自行附着于类器官，并逐渐与其融合，最后侵袭脑组织中，表现出较强的侵袭能力。Ogawa 等[27]将肿瘤类器官注入了免疫缺陷小鼠的海马单侧位，通过HE染色发现这些肿瘤细胞会沿着血管开始扩散，显示出了广泛的侵袭性和细胞核多形性，与患者胶质瘤具有相似的生物学特性;在肿瘤冰罩周围发现了大量Ki-67，CD31，预示着肿瘤组织高度血管生成过程，并且发现了胶质瘤干细胞标志物，证实了类器官来源的肿瘤细胞具有患者肿瘤的生物学特征，可作为胶质瘤研究的良好材料。这些研究也表明，类器官模拟胶质母细胞侵袭培养时间短、移植成功率高、侵袭性强，且保留肿瘤关键生物学特征，为研究胶质瘤的作用机制提供基础。未经治疗的神经胶质瘤类器官可以在模型中引起肿瘤，治疗的神经胶质瘤类器官也可引起肿瘤。这类模型可用于研究治疗前后肿瘤的变化。从同一患者不同时间点采集的肿瘤样本也可以生成成对的纵向模型，从而再现疾病随时间的进展【28】。

肿瘤微环境

胶质瘤不是一种细胞自主的疾病，而是一种癌细胞与宿主细胞生物学密切相关的疾病，胶质瘤细胞可扩散、侵袭周边的正常脑组织继而造成患者死亡。肿瘤微环境的研究对分析胶质瘤的异质性、可塑性和进化过程中发具有重要意义【29】。胶质瘤干细胞不仅可以更新、增殖[30-31]、分化成不同的肿瘤细胞，还可以通过与细胞间质、细胞外间质、肿瘤相关成纤维细胞、免疫细胞、分化神经细胞等不同肿瘤成分相互作用，造成肿瘤的进一步恶性转化，也可增加肿瘤治疗时的耐药性[32]。Oberheim等[33]曾建立一种患者来源胶质瘤类器官的小鼠移植模式，该模型并不理想，虽解决了宿主-肿瘤细胞相互作用的问题，但在解剖学上存在物种差异，且发现细胞水平，星形细胞树突状复杂性、钙瞬态传输速度等也存在明显差异，因此肿瘤微环境的研究并未深入。随着类器官培养技术不断提升，已有可培育出成熟的胶质瘤类器官，用于研究肿瘤微环境。

胶质瘤类器官模型解决了传统的二维培养无法模拟的许多局限性，打破了保存亲代肿瘤的细胞和突变多样性方面的局限性，它允许人们在类似于原始人类大脑的微环境中体外研究患者特异性胶质瘤细胞。脑器官生长患者的胶质瘤的生物学行为和组织病理学特征与手术和尸检标本密切相关，证明了该模型的临床相关性。胶质瘤类器官维持患者特异性EGFR扩增和磷酸化RTK信号，以及胶质瘤样器官微管的自发形成，原位的微结构特征也进一步证实了这一点。胶质瘤类器官模型允许体内肿瘤物质在足够的脑微环境中增殖，包括结构（血管系统、血脑屏障）、细胞（神经元、胶质、小胶质细胞/巨噬细胞）和代谢成分（脑脊液、间质液）。该方法还可避免因体外长期培养和类器官扩增而导致微环境丢失、变化和细胞异常。

总结

虽然胶质瘤类器官的使用为胶质瘤的诊断和治疗带来了新的机遇，但也有几个主要的问题：首先是，大脑类器官成熟度争议，有研究认为脑类器官成熟过低，相当于孕期胎儿成熟度，而胶质瘤干细胞更善于侵入成熟的大脑[34-35]，但随着技术的不断进步，逐渐培养出更接近成熟的人类大脑类器官。其次，缺乏完整的肿瘤微环境，胶质瘤是一种晚发性疾病，理想的模型需要具有成熟细胞类型的星形胶质细胞、少突胶质细胞、髓鞘神经元和小胶质细胞免疫防御细胞类型的脑器官[36-37]，目前技术水平尚不能完全实现。再次，缺乏内皮细胞形成的血管网络，血管的形成对类器官中氧气以及营养物质的运输尤为重要[38]，最近发展了几种体外诱导大脑器官血管形成的方法[39-40]，但仍需进一步研究。虽然大脑类器官在胶质瘤的研究中有许多方面需要改进，但其在基因水平和形态学能很好的再现肿瘤特征，在临床研究和治疗仍是一个重要研究方向，随着技术的不断进步，必将为胶质瘤的研究提供更好前景。

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