环介导等温扩增技术中对低浓度病原体扩增的改进

庞媛媛 卢志贤 任惠明

摘要：目的 改进环介导等温扩增技术（LAMP），探讨其在病原体检测中的检测限。方法 以结核分枝杆菌核酸检测为实例，建立两组闭管LAMP反应系统：使用锡纸隔离SYBR greenⅠ的反应组及提前加入钙黄绿素染料及辅显剂（溴酚蓝）的反应组，评估两种方法的检测限、污染控制性、直观结果读取，与常规PCR方法作比较。结果 两种闭管分析系统的LAMP技术的检测限为3×100拷贝/µl，高于普通PCR技术的检测限（3×101拷贝/µl），同时两种闭管分析方法未出现污染情况，溴酚蓝作为辅显剂可使阴性样本反应后呈淡紫色，阳性样本反应后呈绿色，更易于直观结果读取。结论 隔离SYBR greenⅠ建立闭管LAMP反应系统及提前加入钙黄绿素染料及辅显剂（溴酚蓝）的闭管LAMP反应系统均具有防污染、低检测限，且加入辅显剂更易于检测限附近的直观结果观察，适合在多种LAMP检测试剂盒中推广应用。

关键词：环介导等温扩增技术;辅显剂;病原体检测;检测限

【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2022）02-01

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型的核酸扩增技术，自问世以来其以独特的等温扩增反应模式摆脱了常规PCR核酸扩增反应中对温度循环仪器的要求，从而极大简化了反应的过程，同时也降低了检测成本，且由于LAMP反应中特殊的引物设计还进一步增强了该反应的敏感性和特异性，使得该技术非常适合作为病原微生物的现场快速诊断方法[1，2]。但也由于LAMP技术过高的灵敏度也带来了更加严峻的反应后扩增产物的污染问题和极低浓度结果的直观判断。本研究以结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）核酸检测为实例，拟建立以闭管分析及溴酚蓝为辅显剂的LAMP改进技术，并探讨其在病原体检测中的检测限。

1资料与方法

1.1材料和试剂

MTB Rv株DNA、MTB Rv株DNA LAMP检测试剂盒均由解放军结核病研究所提供，溴酚蓝为天津市科密欧化学试剂有限公司产品（AR）。

1.2方法

1.2.1MTB基因组DNA稀释试验

取浓度为3×104拷贝/μl的结核杆菌Rv株DNA原液，按照10倍的梯度稀释5次，最后取3×104、3×103、3×102、3×101 、3×100及3×10-1拷贝/μl浓度模板进行后面的LAMP反应。以纯水作为阴性对照用液。

1.2.2隔离SYBR greenⅠ的LAMP闭管分析方法

LAMP反应前将锡纸折叠成凹状后塞入EP管内上端，纸壁与管壁之间留有较小空间缝隙，在锡纸凹状纸壁上滴2μl SYBR greenⅠ，由于染料无法渗透过锡纸，故反应前利用锡纸与管壁的摩擦力克服锡纸本身与染料的重力，使得原本会抑制反应的染料在反应过程中停留在锡纸的凹状纸壁内无法进入反应液中，反应后用离心机离心反应管使染料从纸壁与管壁间的缝隙中落入反应液，从而完成了不开盖的检测过程[3]。

1.2.3提前加入钙黄绿素染料及辅显剂（溴酚蓝）的LAMP闭管分析方法

LAMP反应前提前加入钙黄绿素染料及溴酚蓝溶液2μl，然后再按LAMP反应操作进行。

1.2.4LAMP反应及PCR反应

LAMP反應及PCR反应均按MTB基因各自的检测试剂盒说明书进行操作[4]。所用的MTB基因引物序列共计6条，见表1。LAMP反应条件：水浴63℃，加热45min。空白对照模板为水。PCR反应模板设置同LAMP一致，上下游引物分别为LAMP第一组引物中的F3，B3。反应程序为94℃1min（变性），60℃1min（退火），72℃90s（延伸），30个循环。反应后LAMP结果和PCR结果根据2%琼脂糖凝胶电泳判定。

2结果

反应结束后，分别观察提前加入钙黄绿素染料的反应组和使用锡纸隔离SYBR greenⅠ组反应后的颜色变化。通过肉眼观察颜色判定结果，两种闭管系统LAMP方法所能检测到的模板拷贝数极限值为3×100拷贝/µl，而常规PCR方法检测限为3×101拷贝/µl，两种闭管体系LAMP检测技术检测限优于常规PCR方法，经过多次实验均未出现假阳性的发生。

3讨论

LAMP等各种分子生物学诊断技术之所以难以大范围的推广应用，一方面是昂贵的诊断成本限制了其大范围的普及[5，6]，另一方面不论是PCR还是LAMP，由于其极高的扩增效率，反应后一旦开盖很容易造成环境中大量的气溶胶污染，给后续的检测带来干扰，容易导致一部分假阳性结果[7]。本研究在保证特异性的同时为了降低反应扩增产物污染所带来的假阳性，提高结果可信度，使用了两种不开盖检测扩增结果的方法，从而避免了反应后开盖检测所导致的气溶胶污染。其中提前加入染料的方法利用反应前氯化锰和钙黄绿素结合抑制了钙黄绿素本身的绿色荧光，反应后由于阳性样本伴随目标基因的扩增产生了大量的副产物：焦磷酸根离子，焦磷酸根离子剥夺了钙黄绿素上的锰离子从而使得钙黄绿素本身的荧光得以释放[8]。在实际使用中我们发现原始配方的染料阴性与阳性样本之间的区分有时并不很明显，由于原染料对于阴性样本反应后显淡橙黄色，阳性样本反应后显淡绿色，在颜色光谱上这两种颜色是紧挨在一起的两个区域，故实际中会对弱阳性的结果判定造成一定程度的困扰。针对这种情况我们改进了原染料的配方，在原始配方的基础上加入了溴酚蓝作为辅显剂，加入辅显剂后，阴性样本反应后呈淡紫色，阳性样本反应后呈绿色，从色轮图上可见这两种颜色间隔相对较远，肉眼分辨这两种颜色相对较容易。而锡纸隔离SYBR greenⅠ组是由于染料中的主要配方钙黄绿素配置成溶液后稳定性较低，故我们自主设计了一种新型的不开盖检测方法，利用锡纸隔绝SYBR greenⅠ染料在反应过程中同反应液的接触，反应后通过离心使染料落入反应液指示反应结果，整个检测过程均可在闭管体系内完成，该方法简单易行同时SYBR greenⅠ保存较钙黄绿素染料容易，不需要每次试验前重新配置染料，使得该方法相对于钙黄绿素染料法更加方便。我们的检测发现，无任是提前加入钙黄绿素染料的反应组还是使用锡纸隔离SYBR greenⅠ组，其所能检测到的模板拷贝数极限值为3×100拷贝/µl，而常规PCR方法检测限为3×101拷贝/µl，两种闭管体系LAMP检测技术检测限优于常规PCR方法，经过多次实验均未出现假阳性的发生。且加入溴酚蓝作为辅显剂（虽然加入辅显剂后对于扩增效率会有一定程度的限制，延长了一部分反应时间，但对于结果判定具有显著优势）更易于直观结果的读取，适合在多种LAMP检测试剂盒中推广应用[9]。

参考文献：

[1]Vesper S， McKinstry C， Hartmann C， et al. Quantifying fungal viability in air and water samples using quantitative PCR after treatment with propidium monoazide （PMA）[J]. Journal of Microbiological Methods， 2008，72（2）：180-184.

[2]孙艳杰.环介导等温扩增法对痰标本中结核分枝杆菌检测效果的评估[J].世界最新医学信息文摘，2018，18（39）：131，133.

[3]Notomi T， Okayama H， Masubuchi H， et al. Loop-mediaied isothermal Amplification of DNA[J]. Nucleic Acid Res， 2000，28（12）：63.

[4]Tomita N， Mori Y， Kanda H， et al. Loop-mediated isothermal amplification （LAMP） of gene sequences and simple visual detection of products[J]. Nat. Protoc， 2008，3（5）：877-882.

[5]顾锦，郭会，周围，等.环介导等温扩增技术在下呼吸道感染常见病原體检测中的应用[J].临床检验杂志，2021，39（1）：12-16.

[6]顾渊，岑铭松，马海杰，等.柑橘溃疡病菌环介导等温扩增快速检测技术研究[J].浙江农业学报，2017，29（1）：113-118.

[7]Aryan E， Makvandi M， Farajzadeh A， et al. A novel and more sensitive loop-mediated isothermal amplification assay targeting IS6110 for detection of Mycobacterium tuberculosis complex[J]. Microbiol Res， 2010，165（3）：211-220.

[8]Verettas D，Kazakos C，Tilkeridis C. Polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium tuberculosis in synovial fluid tissue samples，bone marrow aspirate and peripheral blood[J].Acta Orthop Belg， 2003，69（5）：396-399.

[9]刘亚东，冷雪，时坤，等.环介导等温扩增技术检测方法的研究进展[J].中国人兽共患病学报，2018，34（5）：460-465.