碳点在组织再生支架中的应用研究进展

李泽华，谢元栋，詹骆宁，胡 玲，刘晓莉，李 毅*

(1.吉林大学口腔医院儿童口腔科，吉林 长春 130021；2.吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室，吉林 长春 130021)

早在2004年, 美国科学家Xu等[1]通过纯化电弧放电制备单纯碳纳米管时, 发现了一种新型荧光纳米材料——碳点(carbon dots，CDs)，在后续的一系列实验中证明碳点具有良好的生物相容性、水溶性和稳定性，毒性低，易合成，易表面修饰。近年来，碳点已被广泛应用于生物传感、药物传递、生物成像、清除自由基等领域[2-3]。目前，已有许多学者尝试将其应用于生物支架领域，以期弥补现有支架难检测、难降解的问题。作者在简单介绍碳点的制备方法及生物学性质的基础上，对其在组织再生支架中的作用进行综述，拟为碳点应用领域的拓展提供帮助。

1 碳点的制备方法

碳点的制备方法主要分为自下而上(bottom-up)和自上而下(top-down)两大类。自下而上指的是通过小分子合成碳点，代表方法有水热法、热解法、溶剂法、微波法及反胶束法等。自上而下则是将大块碳骨架材料剥离或裂解为尺寸小于10 nm的碳点，代表方法有电弧放电法、激光消蚀法、电化学法及超声法等[4]。2013年，Zhu等[5]采用水热法制备的碳点产率高达80%，大大提高了碳点应用的可行性。

2 碳点的生物学性质

2.1 碳点的荧光性质

碳点是由sp2/sp3碳原子组成中心的碳核结构及表面大量的聚合物链/官能团构成的纳米荧光碳材料，主要分为石墨烯量子点(GQDs)、碳量子点(CQDs)、碳纳米点(CNDs)及碳化聚合物点(CPDs)[6]，但也有学者认为CQD归属于GQD或CND[7]。碳点的发光有着明显的激发波长依赖性，发光机理尚在研究中，但目前已有几种较为明确的解释，分别为共轭π域的量子限域效应、缺陷态发光、特定分子的分子态发光及交联增强发射效应[6-10]。

碳点一般在紫外区(230～300 nm)有较强的吸收能力[11]。许多研究者[12-13]通过不同的方法制备了紫外碳点，但由于紫外线穿透能力弱，人们开始尝试制备红光碳点，以达到临床使用的要求。Yang课题组[14]以多巴胺及邻苯二胺为原料，采用水热法制备近红外碳点，在激发波长为800 nm、发射波长为710 nm时，产率达到了26.28%。随后，以红豆杉叶为原料制备的高性能深红色发光碳化聚合物点在激发波长为413 nm、660 nm时，产率分别高达59%、31%，且拥有20 nm的极窄半高峰宽(FWHM)；在体内试验中用640 nm波长激发后用705 nm发射波长评估其在裸鼠体内的成像性能，发现可以观察到明亮的荧光[15]。近期有研究者[16]通过简单改变pH值的方式制备了具有可调荧光特性的碳点，拓展了碳点的应用领域。

由于碳点发射波长与表面态密切相关，相较于紫外碳点，红光碳点产率更低[17]，需开发更可行的方法提高产率以推广应用。

2.2 碳点的生物相容性

已经有大量文献证明碳点具有低毒性及良好的细胞相容性。Xie课题组[18]采用液体激光烧蚀(LAL)法用无烟煤制备了碳量子点，通过细胞毒性及细胞凋亡来检测其对NP69细胞、RAW264.7细胞的生物相容性，发现其与阴性对照之间没有显著差异，证明碳量子点对细胞系没有毒性；通过检测雄性BALB/c小鼠外周血中性粒细胞ROS水平及CD标志物来检测其体内免疫毒性，发现碳量子点注射后既不会诱导氧化应激，也不会引发肝脏的免疫反应，证明碳量子点没有免疫毒性。Chang等[19]以干薄荷为原料，采用水热法制备了可以在体内外特异性检测Fe3+的黄色碳点，发现其在体外具有超低毒性，并将其成功应用于斑马鱼的体内成像。

3 碳点在组织再生支架中的作用

3.1 提升支架的机械强度

对于不同形式的支架，选择合适的碳点引入可以对其机械强度有一定的提升作用[20-21]。碳点由于其表面官能团的区别，在引入各类支架时对其机械强度影响的原理有所不同。

Zhu等[22]用热磁疗(MHT)的方式制备了尿素及柠檬酸的碳点，并经过不同的金属离子(Na+、K+、Zn2+)修饰后分别引入PCL(polycaprolactone)支架中通过电纺丝方式得到不同的PCL/CDs复合支架，相较于纯PCL支架的拉伸强度(3.16 MPa)，引入了碳点的PCL/Na-CDs、PCL/K-CDs、PCL/Zn-CDs复合支架的拉伸强度均明显提高，分别达到4.68 MPa、4.02 MPa、5.37 MPa，这说明碳点与PCL之间的物理相互作用及化学交联可以提高支架的拉伸强度；PCL/Zn-CDs复合支架的拉伸强度为纯PCL支架的1.7倍，且其升幅明显大于PCL/Na-CDs和PCL/K-CDs，这说明强离子络合反应在该类支架的机械强度提升方面起着关键作用。

Rizzo等[23]将氮掺杂碳纳米点(NCND)与离子液体(IL)制成NCND-离子凝胶，并证实了其在紫外线照射下呈现NCND的蓝色荧光；通过检测其凝胶特性发现，NCND的存在基本不影响凝胶的热稳定性、临界凝胶浓度和聚集体大小，甚至由于引入的NCND中富含(伯)氨基，能促进氢键的形成，使形成的凝胶更坚固。

Dai等[24]将柠檬酸及乙二胺的碳点掺入PVP-PES(polyvinylpyrrolidone and polyethersulfone)膜中，发现该复合膜较原始膜拥有更高的断裂拉伸强度和更好的柔韧性，这可能与碳点上的有机官能团相关。

3.2 提高支架的促组织再生能力

过去人们对组织再生支架的期待除了有一定的机械强度外，还有维持细胞正常生存微环境的能力[25]，但目前对支架的研究已经不满足于单纯维持细胞生存，更期望支架能促进组织增殖或定向分化。

Kanagasubbulakshmi等[26]将尿素的碳量子点通过水热处理引入聚丙烯腈(PAN)纳米纤维支架中，并将其与细胞共培养后发现细胞在复合纳米支架上呈现稳定的绿色荧光，不仅如此，相较于纯PAN支架，复合纳米支架还能够抑制支架表面的大肠杆菌生长，充分展示了碳量子点的抑菌性能。将2种支架植入白化Wistar大鼠的皮下袋中评估再上皮化的能力，结果发现，15 d时，在纯PAN支架组中能看到表皮溃疡以及真皮下纤维胶原基质炎性浸润明显，甚至可见脓肿形成；而复合纳米支架组中仅观察到单核细胞浸润及血管充血的现象。在这一过程中，碳量子点的导电性质和吸水能力增强了成纤维细胞的黏附及增殖能力，从而为再上皮化提供了良好的平台。

Yan等[27]采用电化学法制备碳量子点，并将其与丝素蛋白/聚乳酸(SF/PLA)混合通过电纺丝法制备CQD@SF/PLA支架，发现碳量子点的引入不会影响SF/PLA支架的外部形态，但对其电活性有着重要的影响。较高比例(10%～15%，质量分数)的碳量子点可以显著降低SF/PLA支架的溶胀率。通过细胞实验发现，与纯SF/PLA支架相比，碳量子点的引入提高了细胞的增殖及黏附能力，同时，还能促进心肌细胞更好地表达心源性标记基因，如ATPase2a及Anf等。

Wang等[28]采用一步热解法将葡萄糖酸锌制备成锌钝化碳点(Zn-CDs)，并通过直接滴加的方式将其引入明胶/羟基磷灰石(GH)纳米纤维支架中。发现Zn-CDs能与支架较好地结合得到复合纳米支架；在合适浓度范围内葡萄糖酸锌可能是通过MAPK途径促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化；复合纳米支架在体内试验中不仅有支持骨形成的作用，还能加快GH的降解。

3.3 支架植入后的监控作用

碳点的荧光特性对于生物成像有着举足轻重的作用，其既可以单独使用[18]，也可以掺入到其它材料中联合使用。

Dehghani等[29]采用水热法将胶原蛋白制备成碳量子点，并将其均匀分散在PLA支架中得到复合支架。该复合支架表现出较高的生物相容性及光稳定性；相较于完全不能检测出返回信号的纯PLA支架来说，在仿生条件下，该复合支架能够观察到不同深度(0～1 500 μm)的支架结构，并能够在300 μm厚度范围内单独识别PLA支架的差异。这得益于碳量子点能在1 500 μm的深度吸收780 nm(35 mW)的激光后发出足够光电倍增管(PMT)检测到的信号。这种对细胞生物活性的准确、非侵入性、稳定的监控在再生医学及组织工程学中有着重要的意义。

Zhang等[30]基于伤口感染时pH值改变的原理，设计了载有以半胱氨酸为原料的pH值敏感型碳量子点-血红蛋白(Hb)的海藻酸钠(SA)可注射水凝胶，发现其能在伤口感染时发出绿色荧光，在伤口正常修复时发出蓝色荧光。这种荧光改变可以清晰地反映伤口的感染情况，利于检测伤口恢复情况。

4 展望

组织再生要求支架具有足够的机械强度，同时还需提供细胞生存的适宜微环境。目前大部分正在研究的碳点与支架的关系都仅仅为单纯引入的关系，碳点作为表面具有丰富官能团的粒子在参与支架的制备过程中不仅能一定程度增强支架的部分性能，还具有对植入支架的无创性精准监控的优势，有望在未来生物再生领域拥有更好的应用前景。但目前还有诸多问题亟待解决，如如何有效制备出红光碳点、如何制备并筛选最适合特定组织再生的碳点、如何使含碳点的支架在无创检查时更加精准且长期显示组织的再生情况等。相信未来几年内碳点的制备及各种机制将被勘破，届时将能更精准地解决目前所面临的问题。