孤儿核受体TR4在非酒精性脂肪性肝病小鼠模型中的表达变化及浙八味煎剂的干预作用

温晋锋 戴泽 邓凯莉 杨冬雪 杨萍 唐春兰 周玉平*

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已经成为全球主要的慢性肝病［1］。NAFLD 为一组疾病，具体包括非酒精性肝脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［2］。目前对于NAFLD 还没有批准的治疗药物［3］，而对于NASF、HCC 的治疗更是缺乏有效手段［4］。本课题组前期研究证实，基于浙江道地药材为主的验方“浙八味煎剂”对NAFLD 及相关的肝纤维化具有明显的干预效应［5-6］，并获得了国家发明专利授权［7］，但其机制尚待进一步研究。孤儿核受体TR4（Testicular orphan nuclear receptor 4，TR4）与糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗密切相关［8］，基因敲除小鼠模型研究证实TR4 与肝脏脂肪代谢有关［9］，但尚未进一步深入研究其在脂肪肝中的作用及机制。本研究拟通过小鼠模型，探究TR4 蛋白在非酒精性脂肪性肝病动物模型中的表达变化及“浙八味煎剂”的干预作用，旨在进一步探寻NAFLD 的干预靶标，并探究中药验方“浙八味煎剂”对NAFLD的疗效和机制，为研发安全有效的中药新药进行实验研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8 周龄SPF 级C57BL/6J ♂小鼠，体重（24±3）g，共32 只，购自江苏集萃药康生物科技有限公司，生产许可证号SCXK（苏）2018-0008。动物实验在宁波大学实验动物中心进行，动物使用许可证号SYXK（浙）2019-0005，本研究经宁波大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂 蛋氨酸-胆碱缺乏饲料（MCD，批号TP3005G）及对照饲料（MCS，批号TP3005Gs）购自南通特洛菲饲料科技有限公司；甘油三酯（TG，批号A110-1-1）、谷丙转氨酶（ALT，批号C009-2-1）、谷草转氨酶（AST，批号C010-2-1）、总胆红素（TBIL，批号C019-1-1）均购自南京建成生物工程研究所。TNF-α（F2163-A）、IL-1β（F2040-A）、IL-6（F2132-A）购自上海科兴。BCA 蛋白定量试剂盒（BCA Protein Assay Kit，批号E-BC-K318-M，Elabscience）；油红O 染色液（批号G1261）购自北京索莱宝科技有限公司；Rabbit Anti TR4（PP-H0107B-00）购自美国RnD Systems 公司；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（批号HC301-01）、辣根酶标记山羊抗鼠IgG（H+L）（批号HS201-01）、辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（批号HS101-01），购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 方法 （1）动物分组和造模：适应性喂养5 d 后，实验小鼠随机分成4 组即正常组（N）、模型组（M）、浙八味煎剂高剂量组（H）、低剂量组（L），每组8 只。除正常组外的小鼠均进行造模，采用蛋氨酸-胆碱缺乏（MCD）饮食诱导+每周一次腹腔注射10% CCl4-橄榄油溶液，剂量为2 mL/kg，共6 周。正常组小鼠仅给予MCS 饲料常规喂养。（2）浙八味煎剂制备及给药方法：按本课题组建立的方法［7］，浙八味煎剂成人一日剂量：浙贝母12 g、温郁金12 g、白术15 g、杭白菊12 g、白芍12 g、杭麦冬12 g、玄参12 g、延胡索9 g，生药量共96 g。取两剂生药，常规水煎两次混合，旋蒸发至浓度为0.7、0.35 g/mL 两种浓度。按70 kg 成人与小鼠体表面积换算法，小鼠每日每千克体重的高、低剂量分别为14 g 和7 g 生药量，每日灌胃两种浓度的药液为20 mL/kg，自造模第3 周首日开始，每日灌胃一次，共4 周。（3）标本留取方法：6 周末各组动物禁食12 h，麻醉后打开腹腔，下腔静脉采血，切取肝脏，选1 块置于10%中性福尔马林溶液中固定，用于石蜡包埋；另取一叶切成方形，OTC 包埋后液氮速冻用于制备冰冻切片；其余液氮速冻后-70℃保存。（4）生化指标和炎症因子检测：炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 均采用ELISA 试剂盒，操作步骤根据说明书进行。血清、TG 含量检测及ALT、AST、TBil 活性检测均采用生化试剂盒进行。（5）组织病理学观察：制作肝组织石蜡切片，行HE 染色、Masson 染色观察组织炎症和胶原增生情况。制作肝组织冰冻切片，油红O 染色观察肝组织脂肪沉积情况。（6）Western blott：提取组织蛋白，根据BCA 试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性，上样，进行凝胶电泳2 h，后转PVDF 膜2 h，孵育TR4 一抗，4℃过夜；孵育二抗溶液，室温放置60 min，化学发光法检测条带。软件分析抗体条带灰度值，再进行半定量统计。（7）免疫组化：石蜡切片经烤片、脱蜡、水化、抗原修复、消除内源性过氧化物酶、通透预处理后，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗TR4（1 ∶100），放入湿盒中，4℃孵育过夜，取出4℃孵育过夜湿盒，室温静置45 min，PBS 浸洗玻片3 次，每次5 min，滴加HRP（m）（1 ∶100），37℃孵育30 min，PBS 充分淋洗。DAB 显色5～10 min，在显微镜下掌握染色程度，PBS 或自来水冲洗1 min 后苏木精复染3 min，盐酸酒精分化，返蓝，自来水冲洗1 min，脱水、透明、封片、镜检。

1.4 统计学方法 采用GraphPad 9.0 统计软件。计量资料符合正态分布以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 浙八味煎剂对肝组织病理的影响 HE 染色显示，模型组肝组织可见大量脂肪变性，胞质内充满脂滴空泡，汇管区炎症细胞浸润严重，浙八味煎剂干预后脂肪变性和炎症反应程度都明显减轻，其中高剂量组效果更好，见图1。Masson 染色显示，模型组肝组织胶原沉积明显增加，窦周可见胶原纤维形成细丝状甚至粗索状分布，肝小叶结构紊乱，局部可见纤维组织增生；浙八味煎剂高剂量组干预后胶原沉积明显减少，见图2。

图1 浙八味煎剂对模型小鼠肝脏纤维化的影响。A. Masson染色（×100倍）胶原纤维呈蓝色；N：正常组，M：模型组，H：浙八味煎剂高剂量组，L：浙八味煎剂低剂量组。B. 胶原容积分数，与正常组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

图2 浙八味煎剂对模型小鼠肝功能和总胆固醇水平的影响。高脂饮食诱导的脂肪肝小鼠、药物处理后的脂肪肝小鼠与正常组的血清TG含量（A）、肝组织TG含量（B）、血清AST（C），血清ALT（D）以及Tbil（E）的比较；N：正常组，M：模型组，H：浙八味煎剂高剂量组，L：浙八味煎剂低剂量组。注：TG，甘油三酯；ALT谷丙转氨酶；AST谷草转氨酶；TBil总胆红素。与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

2.2 浙八味煎剂对肝组织脂质代谢和肝功能的影响 与正常组相比，模型组肝脏中TG 含量、ALT 与AST 活性和TBil 含量显著升高（P＜0.01），表明模型小鼠出现了脂代谢紊乱和肝脏脂质蓄积，并造成了肝脏损伤；小鼠经浙八味煎剂连续灌胃给药4 周后，肝组织TG 含量、ALT 与AST 活性和TBil 含量降低，与模型组相比具有差异（P＜0.05 或P＜0.01），提示了浙八味煎剂可以逆转模型小鼠的肝细胞脂肪变性与损伤，见图3。

图3 浙八味煎剂对小鼠肝脏炎症因子的影响。高脂饮食诱导的脂肪肝小鼠、药物处理后的脂肪肝小鼠与对照组的IL-1β表达（A）、IL-6 表达（B）、TNF-α表达（C）的比较；N：对照组，M：模型组，H：浙八味煎剂高剂量组，L：浙八味煎剂低剂量组。注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

2.3 浙八味煎剂对肝组织炎症反应的影响 通过ELISA 检测模型小鼠肝组织炎症因子的表达水平，与正常组相比，模型小鼠肝组织中内IL-1β 表达上调（P＜0.05），浙八味煎剂高剂量组降低模型组IL-1β 的表达（P＜0.05）。IL-6 和TNF-α 的表达在本实验中未见正常组和模型组有差异，但与模型组相比，浙八味煎剂高剂量组能降低两个炎症因子的表达水平，具有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），见图4。

图4 免疫组化检测浙八味煎剂对肝组织TR4蛋白表达的影响。N：正常组，M：模型组，H：浙八味高剂量组，L：浙八味低剂量组

2.4 浙八味煎剂对肝组织TR4 蛋白表达的影响 通过Western blot 和免疫组化观察了模型小鼠肝组织TR4 蛋白表达变化及浙八味煎剂的干预作用，与正常组相比，模型组肝组织中TR4 蛋白的表达明显增多，阳性表达主要分布在肝细胞的细胞核及细胞浆（P＜0.01）。浙八味煎剂干预能降低TR4 蛋白的表达，与模型组相比具有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

图5 蛋白免疫印迹检测浙八味煎剂对肝组织TR4蛋白表达的影响。N：正常组，M：模型组，H：浙八味高剂量组，L：浙八味低剂量组。注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

3 讨论

近年研究显示，孤儿核受体TR4 与糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗密切相关，但尚未进一步深入研究其在脂肪肝中的作用及机制。KIM 等［10］通过TR4 基因敲除小鼠体内实验及原代肝细胞体外实验发现，TR4 介导肝脏硬脂酰辅酶A 去饱和酶1（SCD1）基因表达，降低胰岛素的敏感度，而敲除TR4 可以抑制SCD1 表达，并可以减少脂肪沉积及增加胰岛素的敏感度。LIU 等［11］研究还发现，空腹和胰高血糖素介导的信号cAMP/PKA 和C/EBP 信号通路可以激活TR4 导致糖异生。此外，TR4在促进脂质代谢中也发挥了重要作用。YOSHIZAWA 研究发现，肝脏组蛋白去乙酰化酶SIRT7 基因敲除小鼠，由于TR4 表达水平的降低，表现出对高脂饮食诱导的肝脏脂肪变、肥胖、糖耐量受损的抵抗作用［12］。KIM等［13］通过基因敲除小鼠研究证实，TR4 调节ApoE 基因表达，TR4 的缺失下调肝细胞中载脂蛋白E/C-I 和C-II 基因表达。

综上所述，TR4 能导致糖脂代谢紊乱，增加胰岛素抵抗，促进甘油三酯在肝脏堆积，但既往的研究主要集中在代谢综合征领域。由于胰岛素抵抗及脂代谢紊乱在NASH 发病机制的关键作用，笔者推测TR4 蛋白可能是NAFLD 的发病机制之一。本研究通过建立NAFLD 疾病模型，研究发现在NAFLD 动物模型中，肝组织TR4 蛋白的表达较正常组明显升高。浙八味煎剂能明显减少脂肪在肝内沉积，逆转TR4 蛋白的升高，减轻肝组织的炎症反应。提示TR4 可能作为浙八味煎剂的效应靶点，从而缓解了非酒精性脂肪性肝病的发展。本研究不足之处为此次研究仅是对TR4 在NASF 模型中表达变化及中药复方干预作用的一个初步观察，推测TR4 可能的一个有效的干预靶标，如果需要更明确这一论点，还需要使用TR4-/-小鼠模型进行验证。