黑柿叶中单宁提取工艺研究

宋 超，程洪斌，窦思远，李泯锟，王 耘*

（金陵科技学院园艺园林学院，江苏南京 210038）

柿子在我国有着悠久的历史，种植面积和产量位居世界之首。柿果实营养丰富，含有多种抗氧化功能性成分[1]，其中单宁是柿功能性成分中最具关注的一种，它赋予柿子特有的涩感，多羟基酚类的结构决定了它还有吸收紫外线、清除自由基、防腐和美白保湿等诸多优良特性。目前柿单宁提取多以果实为原料，柿叶利用较少，而研究发现，柿叶中也富含多酚类、黄酮类、萜类、鞣质等多种功能性成分[2]，以柿叶为原料提取柿单宁，可以减少果实资源的浪费。

单宁的提取方法多种多样，例如水提取法、有机溶剂-水提取法、仪器辅助提取法等，目前常采用超声波辅助法提取单宁[3-4]。如余先纯等[5]采用该方法以70%的丙酮溶液为溶剂提取野柿叶中的单宁，曾鑫海等[6]用此法以及邻二氮菲分光光度法来提取橄榄中的单宁，王秋亚[7]用50%乙醇提取苦菜中的单宁，从提取温度、提取时间、料液比等方面考察对单宁提取量的影响。黑柿是黑色柿品种[8]，前期的研究发现，黑柿叶中单宁含量相比较红柿叶中多，因此，黑柿叶可以作为一种较好的提取单宁的新资源。关于黑柿叶单宁提取方法和抑菌活性相关的报道极少[9]，本试验在前人研究基础上，通过单因素试验和正交试验，研究了超声辅助提取黑柿叶中单宁的最佳工艺，并对黑柿叶中的单宁抑菌性进行了研究，该结果为黑柿叶资源开发利用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 柿叶的制备

试验当天在金陵科技学院园艺站进行黑柿叶片采样，将样品在95℃条件下烘干（至恒重），研磨后过40目筛，粉末密封保存置于干燥器中，留待后续试验使用。

1.2 黑柿叶中单宁的提取及测定方法

参照韩卫娟等[10]及于晓锐等[11]对单宁的提取方法，用电子天平精密称取0.2g黑柿叶粉，优化提取液乙醇的体积分数，优化不同料液比，在固定温度下超声提取，过滤，收集滤液，定容至25mL。

通过牛广财等[11]使用的福林-酚比色法测定（略作修改），其中饱和碳酸钠溶液作为提供稳定的碱性环境的溶液，静置显色反应时间改为2h。标准品为没食子酸，并绘制标准曲线，进一步测定样品。

公式中：x是利用标准曲线计算所得到的浓度，mg/mL；V为定容容量，mL；m是样品质量，g；N为稀释倍数。

1.3 超声提取黑柿叶中单宁的单因素试验

1.3.1 不同料液比对提取效果的影响。在60%乙醇、温度60℃、超声频率为100W条件下，分别以1︰20、1︰30、1︰40、1︰50和1︰60（g︰mL）5个料液比进行试验，提取40min，观察不同料液比对提取单宁的影响。

1.3.2 乙醇浓度对提取效果的影响。利用弱酸性醇-水体系能够更好地溶出样品中的缩合单宁[13]。在料液比1︰40（g︰mL）、温度60℃、超声频率为100W的条件下，选择40%、50%、60%、70%和80%5个梯度的乙醇浓度进行试验，提取40min，探索乙醇体积分数对提取效果的影响。

1.3.3 不同温度对提取效果的影响。在料液比1︰40（g︰mL）、60%的乙醇溶液、超声频率为100W的条件下，选取提取温度分别为40、50、60、70和80℃，提取40min，分析单宁提取效果。

1.3.4 比较不同时间对提取效果的影响。在料液比1︰40（g︰mL）、60%的乙醇溶液、超声频率为100W、温度为50℃条件下，选取成梯度提取时间进行试验，时间分别为10、20、30、40和50min，分析单宁提取效果。

1.4 正交试验

根据对上述单因素试验的结果分析后选出了4个因素中较好的水平进行正交试验，确定最佳提取因素和水平（表1）。

表1 黑柿叶单宁提取的正交试验因素水平

1.5 对细菌生长的影响

挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，活化2代后，37℃过夜培养，作为测试菌菌液。取测试菌液50μL接种于25mL培养液中，以提取单宁用无菌水配制成浓度为2.5%、1.25%和0.625%的溶液，在培养液中各添加2.5mL单宁溶液，无菌水为空白，每隔2h取样测定600nm下的吸光值，每组做3个平行。

1.6 统计与分析

采用SPSS10.0软件进行数据分析，数据处理及制图利用Excel2019进行。

2 结果与分析

2.1 单宁标准曲线

以没食子酸质量浓度为横坐标绘制了标准曲线（见图1），没食子酸浓度在0～0.10mg/mL范围内，呈现出较良好的线性关系，此范围内的线性回归方程为y=15.235x+0.0617，R2=0.9983。

图1 没食子酸标准曲线

2.2 单因素结果分析

2.2.1 不同料液比的影响。伴随料液比的逐渐增加，提取量大致呈现出先上升后缓慢下降的趋势，1︰50时的提取量比1︰40时稍高，但是1︰40时，单宁在溶剂中的溶解基本达到饱和，考虑到提取效果和成本的影响及后续浓缩的时间和能耗，可考虑低料液比。

图2 料液比对单宁提取的影响

2.2.2 不同乙醇浓度的影响。单宁的提取量随乙醇浓度增加先升高再下降，主要原因是低浓度时随着乙醇浓度升高，单宁与另外一些物质的键合被打开，从而游离出来，但是高浓度时，水分的减少使得溶液通透性下降，单宁提取率随之下降[14]。

图3 乙醇溶液浓度对单宁提取量的影响

2.2.3 不同提取温度的影响。温度50℃有提取峰值，在此之前升高温度可增加单宁在水溶液中的溶解度，而高于50℃后，黑柿叶中的单宁提取量明显下降，当温度达到80℃时，提取量为123.58mg/mL，仅略高于40℃时（221.15mg/mL）的一半。温度过高，可能加速单宁的氧化和分解或引起单宁结构的变化，导致结果测定出提取的单宁量偏低。因此，传统提取条件下长时间高温不利于活性高的单宁提取。

图4 提取温度对单宁提取的影响

2.2.4 不同提取时间的影响。随着提取时间的延长，单宁提取量有较明显的增加，40min后不再增加。有研究表明，时间过长，会使得单宁中的酚羟基经氧化反应变成酮基，从而使得提取量下降[15]。超声辅助提取既可缩短提取时间又能降低提取温度，可提高柿叶中单宁的提取率。

图5 超声波提取时间对单宁提取量的影响

2.3 最佳提取工艺的优化

在单因素试验的结果上，正交试验结果及极差分析可知（表2），影响黑柿叶单宁提取率的4个因素的主次关系为提取温度（A）＞料液比（D）＞提取时间（B）＞乙醇浓度（C）。最佳提取条件为A1B2C2D3，即提取温度50℃，提取时间40min，60%乙醇，料液比1︰50（g︰mL）。

表2 黑柿叶片单宁提取的正交实验结果

2.4 柿叶单宁对细菌生长影响的分析

试验采用分光光度法，以光度值来表示细菌效果。由图6可知，只有2.5%黑柿叶单宁在大肠杆菌生长至对数期之前稍微有抑制效果，其他浓度都没有抑制作用。由图7可知，不同浓度的黑柿叶单宁对金黄色葡萄球菌的抑制效果都较好，4h后对照组中金黄色葡萄球菌开始快速增殖，至6h后悬浮液的吸光值明显高于试验组，且之后试验组的增殖一直很缓慢，单宁浓度相对较高时抑菌性更好一点。说明黑柿叶中单宁对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用。

图6 黑柿叶单宁对大肠杆菌生长的影响

图7 黑柿叶单宁对金黄色葡萄球菌生长的影响

3 结论

（1）根据上述优化工艺，利用60%乙醇、1︰50（g︰mL）料液比、超声频率100W的条件下，50℃提取40min时，可以较好地提取出黑柿叶中的单宁成分。

（2）不同浓度的单宁溶液对2种不同细菌（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）的繁殖生长有不同的影响。与喷洒了无菌水的2种细菌培养基相比，添加了单宁溶液的金黄色葡萄球菌培养液中，菌体增殖较缓，而对大肠杆菌的抑制作用不明显，由此可明显看出，单宁溶液具有一定的抑制金黄色葡萄球菌的能力，2.5%单宁溶液的抑菌效果更好一些。

黑柿叶片是提取单宁的一种很好的原料，可有效利用黑柿叶资源，研发天然防腐剂，对资源合理应用和食品防腐具有较好的研究意义。