防御素的生物学功能及其在畜牧业的应用研究进展

邱晓媛 郭广振 吴鹏鑫 尹福泉

(广东海洋大学滨海农业学院，湛江 524088)

防御素(defensins)广泛存在于动物、植物和微生物中，属于抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)的一种。防御素由于具有抑制微生物活性、抗菌谱广、无免疫原性及稳定性强等特点，受到了国内外研究人员的关注。2019年，《中华人民共和国农业农村部公告第194号》公布退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种[1]，这表明寻找能代替抗生素的安全替代物成为保证畜牧业可持续发展的重点。研究发现，防御素具有代替传统抗生素的潜力，在抗微生物活性、免疫调节和抗氧化等方面都能发挥一定的作用。因此，本文综述了防御素的抗病原微生物活性、免疫调节和抗氧化这3种生物学功能以及防御素在畜牧业的应用研究进展等，以期为防御素研究及其在实际畜牧生产中的应用提供参考依据。

1 防御素分类和结构

防御素是一类小分子AMPs，富含半胱氨酸(cysteine,Cys)，最初是在1980年被分离得到。在有脊柱动物中，包括哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼类和两栖动物，都发现了防御素的存在。研究表明，防御素存在于皮肤、呼吸道、生殖道和胃肠道的中性粒细胞、巨噬细胞或上皮细胞中，由中心粒细胞、巨噬细胞和单核细胞等吞噬细胞产生；其由18～45个氨基酸残基和3个稳定的二硫键组成，缺乏糖基或酰基侧链修饰，带正电荷，具有亲水性和亲脂性，主要的二级结构是β-发夹转角，有的还形成α-螺旋结构[2-6]。

目前，至少有335种防御素被发现，根据二硫键排列位置的不同，可以将其分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素3个亚类。α-防御素是由哺乳动物产生的，至少由1个β-折叠结构组成，在Cys1-Cys6、Cys2-Cys4和Cys3-Cys5之间形成3个二硫键[7]。1991年，研究人员从牛体内发现了牛气管黏膜抗菌肽，这是最早被发现的一种β-防御素，接着又在牛的中性粒细胞中发现了其他β-防御素[8]，而后经过许多研究人员研究发现，β-防御素存在于许多脊椎动物体内[9-11]。β-防御素至少由1个β-折叠结构组成，这一点与α-防御素相同；此外，β-防御素在N端形成了α-螺旋结构，在Cys1-Cys5、Cys2-Cys4和Cys3-Cys6之间形成二硫键[12-13]。θ-防御素存在于灵长类动物中，但不包括人类，最早是在猕猴白细胞中被分离出来；与α-防御素和β-防御素的结构不同，它由2个被截断的α-防御素环化而成，是独特的环状结构，具有9个氨基酸片段，在Cys1-Cys6、Cys2-Cys5和Cys3-Cys4之间形成二硫键[14]。研究表明，α-防御素的祖先是β-防御素，而θ-防御素又是由α-防御素变化得到，3个亚类之间的进化关系解释了β-防御素基因分布之广泛[15]。

2 防御素的生物学功能和作用机理

2.1 抗病原微生物活性

AMPs作为机体的多功能肽，在抗病原微生物活性和免疫调控等方面都起到重要作用，哺乳动物机体内的AMPs可分为防御素和cathelicidins。因此，防御素能在病原微生物入侵机体时起作用。其抗病原微生物活性主要包括抗菌活性和抗病毒活性等。在面对不同的病原微生物入侵时，防御素产生防御的机制也并不相同。由于菌体表面存在磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、心磷脂(CL)和脂多糖(LPS)等物质，使细胞表面带上负电荷[16]。而防御素是带正电荷的多肽，能非特异性地与菌体表面结合，覆盖在菌体表面，通过改变细胞壁通透性的方式，来诱导细胞内成分向外排出，导致细胞死亡[17]。另外，一些防御素还可以通过对细菌细胞壁先行物脂质Ⅱ的限制而杀死细菌[16]。

防御素在不同的环境中发挥抗病毒活性功能的机制并不相同。在有血清的环境中，防御素通过与靶细胞表面受体如G蛋白偶联受体(GPCRs)相互作用，改变下游信号，阻断包膜病毒与细胞复合物的核进入细胞或阻断病毒RNA的转录，导致病毒活性降低[18-21]。在黏膜表面等没有血清的位置，在细胞还未受感染前，防御素便会作用在包膜病毒上，通过破坏病毒包膜，或与病毒糖蛋白相互作用，阻断病毒与细胞的融合，杀灭病毒[19]。

2.2 免疫调节

作为先天免疫防御系统的重要组成部分，防御素具有免疫调节功能。研究表明，防御素对T细胞、单核细胞、中性粒细胞和肥大细胞都具有趋化作用；当病原微生物入侵机体，其通过选择性激发和吸引特定白细胞，参与免疫反应。Chertov等[22]研究表明，0.1～100 ng人β-防御素2(HBD2)和1.0～100 ng/mL阳离子抗菌蛋白37(CAP37)能刺激体外T细胞趋化性，诱导T细胞聚集成熟，促进机体免疫反应能力。Niyonsaba等[23]通过研究不同剂量的防御素对肥大细胞的趋化作用发现，3 mg/mL HBD2能诱导肥大细胞产生最大迁移，快速增加局部组织中肥大细胞数量以应对局部感染。另外，防御素对树突状细胞(DC)具有化学吸引力，刺激其成熟[24-25]；而DC是一种抗原递呈细胞，参与免疫反应。

当机体受到损伤刺激，就会触发炎症反应，炎症的调节关乎机体的健康。在这方面，防御素是通过调节促炎细胞因子和趋化因子来实现的。Miles等[26]研究发现，人α-防御素中性粒细胞肽1(HNP1)能有效诱导巨噬细胞中促炎细胞因子的产生，促进吞噬活性，在小鼠腹膜炎模型中起主要的抗炎作用。HNP1能通过非特异性结合巨噬细胞的mRNA，或抑制tRNA或核糖体蛋白等翻译所需的因子，抑制其翻译，但不影响转录，以此来调节炎症反应，防止反应过度[27]。

抗原递呈细胞上的Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)是一类重要的蛋白质，其虽然主要参与非特异性免疫，但也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。许多研究已经证实，防御素和TLR关系密切。鼠β-防御素2(MBD2)与TLR-4相互作用，通过诱导未成熟的树突状细胞上的CD40、CD80和CD86，刺激T细胞增殖，参与免疫反应[27-30]。MBD2可以激活用TLR-4和髓样分化蛋白2(MD2)转染的人胚肾(HEK)293细胞中的核转录因子-κB(NF-κB)，但不能在未转染的HEK293细胞中激活。另外，已经证实MBD2也作为TLR-4激活DC成熟的内源性配体[29]。

2.3 抗氧化

防御素抗氧化作用的报道较少，作用机理也尚不清晰。薛现凤等[31]研究表明，猪β-防御素1(PBD1)和猪β-防御素2(PBD2)对1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基和羟基自由基表现出清除作用，且清除DPPH自由基能力有与维生素C相同的趋势，并表现出还原力，在该试验条件下，PBD1和PBD2产生抗氧化能力的水平为0～256 μg/mL，且呈剂量依赖效应。

3 防御素在畜牧业的应用研究进展

3.1 在猪生产中的应用

目前已知的猪β-防御素(PBD)有29种，用于研究的PBD大多是通过异源表达生成的，常用的表达方式依次是大肠杆菌、毕赤酵母以及枯草芽孢杆菌。Tang等[32]研究表明，在饲粮中添加PBD2可以提高断奶仔猪的生长性能，促进其肠黏膜绒毛-隐窝结构的发育，有利于小肠提高消化和吸收能力；另外，还可以降低仔猪小肠血清和黏膜中一些免疫因子的浓度，如白细胞介素和肿瘤坏死因子，防止机体炎症反应过度。推荐添加量为1 mg/(d·头)。Peng等[33]研究发现，在断奶仔猪饲粮中添加PBD2，对肠道黏膜发育有积极影响，增加了肠道绒毛高度，降低了隐窝深度，改善了仔猪生长性能；此外，PBD2还可以抑制仔猪肠道有害菌群生长，减少仔猪断奶腹泻的发生，减小断奶应激，推荐饲粮中添加量为5 g/kg。

关于PBD代替抗生素添加在猪精液稀释液中的研究较少。Puig-Timonet等[34]通过在猪精液稀释液中各添加PBD1和PBD2发现，当PBD1添加量为1.5和3 μmol/L时，精子活力没有受到显著影响；而PBD2添加量为3 μmol/L时，精子活力高于1.5 μmol/L添加量，这些结果表明PBD可以添加在精液稀释液中，且与不添加抗生素的稀释液相比，添加3 μmol/L PBD能有效抑制有害细菌的生长。

3.2 在禽生产中的应用

鸡β-防御素(AvBD)是鸡的一类防御素，研究发现其对大肠杆菌和李斯特菌具有抑菌活性[35]。它可以诱导鸡巨噬细胞表达一些细胞因子并刺激丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路来调节免疫系统。除了能促进机体先天免疫，AvBD还能通过CD40影响机体的后天免疫，研究表明其有作为疫苗佐剂的潜力[36-37]。

鸭防御素方面，朱锦兰等[38]通过研究重组鸭β-防御素2制剂对肉鸭生长性能的影响发现，重组鸭β-防御素2对肉鸭生长性能有正面效果，但并未给出最适添加量。另外，严霞等[39]研究发现，重组鸭β-防御素2对多重耐药性大肠杆菌攻毒雏鸡有较好的治疗效果，应用前景良好。

3.3 在反刍动物生产中的应用

金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌的代表，能引起奶牛乳房炎，导致奶牛生产力下降。研究发现，牛β-防御素可以有效抑制金黄色葡萄球菌。通过基因工程技术将一种溶葡萄球菌酶基因进行改造，使其能够在奶牛乳腺中大量表达，从而抑制金黄色葡萄球菌的生长，且在牛奶中不被表达，可用于治疗奶牛乳腺炎[40]。

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)通常定植于家畜肠道上皮细胞上，产生肠毒素而引起家畜腹泻。绵羊β-防御素2(SBD2)是绵羊β-防御素的一种，分离自绵羊胃肠道。邹双霞[41]通过构建SBD2过表达和干扰载体，转染至湖羊小肠上皮细胞中，再用F17大肠杆菌感染湖羊小肠上皮细胞后发现，过表达SBD2后黏附至小肠上皮细胞上的细菌数量显著降低，干扰SBD2后黏附至小肠上皮细胞上的细菌数量显著升高，说明SBD2具有抗F17大肠杆菌感染小肠上皮细胞的能力。

4 小结与展望

作为AMPs的成员之一，防御素不仅具有抗病原微生物活性、免疫调节和抗氧化功能，更多的功能都已被发现并证实。但也有报道称，在一定剂量下防御素会促进肿瘤细胞增殖，有助于肿瘤侵袭；另外，HNP1-3还能诱导细胞凋亡，抑制血管生成[42-44]。由此可见,防御素机制复杂，依旧是今后研究者需要探究的地方。另外，防御素可以清除自由基，在饲料保存和维持微量元素效价方面还存在研究空间。