黏菌素肾毒性的分子机制及其研究进展

李 萌，沈麟杰，代重山

(中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193)

多黏菌素类(Polymyxins)抗生素是一类聚阳离子多肽类药物，主要包括多黏菌素A、B、C、D、E。黏菌素，也叫多黏菌素E，已被广泛应用于治疗革兰阴性菌造成的动物和人类的肠道及肺部感染，对多重耐药革兰阴性细菌(MDR-GNR)感染的治疗效果尤为显著，被称为治疗该类细菌感染的“最后一线治疗希望”。目前，如何延长这一临床上重要的抗菌药物的使用寿命，已成为一个重要的研究课题，其面临的主要问题有2个：一个是如何降低其临床耐黏菌素细菌的发生概率。近年来，我国已明令禁止将黏菌素作为非治疗使用的其他任何用途，明显地减缓了耐黏菌素细菌的传播速度，对控制黏菌素的耐药性做出了积极的贡献[1]。另一个则是如何降低黏菌素的毒性作用，提高其治疗指数。神经毒性和肾毒性是黏菌素临床应用过程中发生的主要毒副作用，其中肾毒性的发生率高达60%以上，远高于其神经毒性的发生率(约7%)，是目前最主要的剂量限制性影响因素，严重降低其临床治疗指数[2]。因此，迫切需要深入理解和探究黏菌素肾毒性的分子机制，这对黏菌素的安全用药及减毒策略的开发均具有重要的科学意义。因此，本文将对黏菌素肾毒性的分子机制的最新研究进展进行综述，同时对相关预防或改善黏菌素肾毒性的药物进行归纳总结，以期为黏菌素的安全用药及相关产品的开发应用提供理论依据。

1 黏菌素肾毒性的分子机制研究现状

1.1 破坏真核细胞的细胞膜结构 已有研究证实，黏菌素诱导肾小管上皮细胞坏死与直接破坏其细胞膜结构相关，这主要与黏菌素的分子结构所携带的D型氨基酸和脂肪酸成分相关，通过降低细胞浆膜表面张力，造成正常肾小管上皮细胞细胞膜通透性增大，最终导致细胞肿胀和溶解，直至死亡[2]。Dai等[3]研究发现，鸡原代神经元细胞暴露于8.3 μg/mL黏菌素24 h后，胞外乳酸脱氢酶(LDH)水平显著增加。LDH胞外释放的增加被认为是细胞膜破坏的典型生化标志物。相似地，Mingeot-Leclercq等[4]研究发现，与黏菌素具有类似结构的多黏菌素B在0.5 mmol/L和1 mmol/L暴露处理猪肾小管上皮细胞(LLC-PK1)48 h时，LDH均显著增加。这些研究表明黏菌素可破坏真核细胞的细胞膜完整性。通过体外生化试验发现，相同剂量的黏菌素对由卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇- 4,5-二磷酸等组成的磷脂双分子层的破坏能力远大于其他常用的抗菌药物，如庆大霉素、卡那霉素和链霉素等，表明黏菌素对真核细胞的细胞膜结构具有一定的特异性毒性作用[5]。迄今为止，关于黏菌素如何作用于真核细胞的细胞膜结构，如何破坏其完整性，确切的分子机制尚不清楚，这些问题仍有待进一步研究。

1.2 诱导细胞氧化应激损伤 氧化应激是指机体由于受到内源性或外源性刺激，使得体内氧化与抗氧化作用间的平衡失常，自由基产生过多，如活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而引发的一系列应激反应。

ROS常包括过氧化氢(H2O2)、超氧自由基(O2·-)、羟基自由基(·OH)和单线态氧(1O2)等自由基。体外多个细胞研究证实，黏菌素暴露可诱导小鼠原代神经元、神经胶质瘤Neuro-2a(N2a)、大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)、人肾脏细胞(HK-2)、鸡原代神经元细胞内ROS大量释放，ROS的过多积累导致氧化应激，氧化损伤蛋白质、DNA和脂质等细胞内大分子，最终导致细胞死亡[3,6-11]。本课题组前期研究证实，小鼠静脉注射7.5 mg/(kg·bw·d)和15 mg/(kg·bw·d)黏菌素，连续注射7 d后，小鼠肾脏组织中脂质过氧化标志物丙二醛(MDA)含量显著升高，抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)活性及谷胱甘肽(GSH)含量显著降低[8]。在细胞内，SOD主要用于清除O2·-，CAT主要用于清除·OH，GSH主要用于清除H2O2，这些抗氧化蛋白在细胞内的降低将加剧其氧化-抗氧化系统的失衡，从而诱导氧化应激损伤[7]。这些研究均表明，ROS介导的氧化应激损伤在黏菌素诱发的肾毒性中扮演着重要角色。

一些研究发现，黏菌素也可诱导RNS的过量产生，从而诱导氧化应激损伤[11-12]。RNS包括一氧化氮(NO)、二氧化氮(NO2)和过氧化亚硝酸盐(ONOO-)等自由基。体外研究证实，375 μmol/L多黏菌素B处理LLC-PK1细胞72 h，显著上调NO的释放[13]。Ozkan等[11]研究发现，在黏菌素诱导的大鼠肾损伤模型中，肾组织中的SOD活力显著降低，诱导性一氧化氮合酶(iNOS)及内源性一氧化氮合酶(eNOS)均显著升高。iNOS或eNOS表达和活性的增加，将促进L-精氨酸(L-Arg)产生NO，过多的NO将直接导致氧化应激损伤。

目前，研究者对黏菌素诱导的ROS或RNS过量产生的分子机制尚不清楚。最新研究发现，黏菌素可通过上调细胞内尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)的产生，从而促进细胞内ROS的产生，诱导肾细胞氧化应激损伤[6]。Wang等[14]最新研究发现，METTL3介导的N6-甲基腺苷(m6A)修饰通过调控miRNA-873-5p表达，从而影响黏菌素诱导的氧化应激及肾毒性。然而，线粒体作为细胞内ROS的主要来源，黏菌素诱导的ROS过量产生是否与线粒体呼吸链的传递遭到破坏直接相关，仍有待进一步的研究。

1.3 诱导细胞凋亡 凋亡是一种细胞程序化死亡，涉及内源性及外源性凋亡途径，主要包括线粒体、死亡受体途径和内质网通路[8,15]。本课题组前期研究发现，小鼠静脉注射15 mg/(kg·bw·d)黏菌素，连续注射7 d后，小鼠肾脏组织中B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)显著降低，Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞色素C(CytC)、凋亡诱导因子(AIF)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-9和Caspase-3等蛋白表达显著增加，这表明线粒体凋亡途径参与黏菌素诱导的小鼠肾毒性，同时也证明，Caspase依赖及非依赖性凋亡均参与黏菌素诱导的细胞凋亡；小鼠肾脏组织中Fas细胞表面死亡受体(FAS)、FAS配体(FASL)、FAS相关死亡域蛋白(FADD)、Caspase-8及其剪切体表达显著增加，表明死亡受体凋亡途径参与黏菌素诱导的细胞凋亡；小鼠肾脏组织中葡萄糖调节蛋白78(Grp78)、活化转录因子6(ATF6)及其剪切体、生长抑制和DNA损伤诱导基因153(GADD153/CHOP)和Caspase-12的表达显著增加，表明内质网凋亡途径参与黏菌素诱导的肾细胞凋亡[8]。

调控细胞凋亡涉及多个信号通路。有文献已证实，在黏菌素诱导的小鼠肾毒性过程中，磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路、核因子κB(NF-κB)信号通路、核因子E2相关因子2(Nrf2)/单加氧酶(HO-1)信号通路、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号通路等多种信号通路被激活[8,16]。然而，目前尚不清楚这些信号通路的激活在黏菌素诱导的肾毒性过程中发挥何种角色，是否与黏菌素诱导的氧化应激及线粒体功能失调直接相关，均有待进一步的探究。

1.4 诱导细胞自噬 动物模型研究证实，在黏菌素诱导的肾毒性模型中，自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达显著增加，使用透射电镜观察发现，肾小管上皮细胞中可以明显观察到自噬体结构出现[8]，表明黏菌素肾毒性过程中可能激活肾脏上皮细胞内的自噬反应。作为一种自我降解过程，自噬可以由ROS或营养缺失胁迫引起，自噬往往与细胞凋亡作用相反，其能够消除错误折叠或聚集的蛋白质，清除受损细胞器，如线粒体、内质网和过氧化物酶体等亚细胞器，从而促进细胞存活[17]。Dai等[18]通过体外细胞试验证实，将转入GFP-LC3质粒的N2a细胞经100 μmol/L黏菌素处理24 h后，绿色荧光斑点显著增多，表明自噬被激活；同时，在细胞内也可观察到明显的自噬小体、自噬溶酶体等; 在使用自噬抑制剂氯喹处理后，显著加剧黏菌素诱导的N2a细胞凋亡，而自噬激活剂雷帕霉素明显改善黏菌素诱导的N2a细胞氧化应激损伤及细胞凋亡。

通过调控细胞自噬控制药物毒副作用、细胞衰老及感染性疾病已被广泛研究。自噬、氧化应激和细胞凋亡三者之间既相互依存，又相互调控，涉及多个信号通路。先前的研究已经证实，p53信号通路、mTOR/ULK1信号通路、JNK信号通路和PI3K/Akt信号通路参与黏菌素诱导的细胞自噬[18-20]。但目前对这些信号通路的激活如何调控黏菌素诱导的细胞自噬，在黏菌素诱导的细胞自噬、氧化应激和细胞凋亡等诸多信号网络过程中发挥怎样的角色，仍然存在诸多疑问。因此，研究黏菌素诱导的细胞自噬仍然是十分重要的科学问题。

1.5 诱导细胞周期阻滞 体外细胞及动物试验证实，黏菌素可诱导肾细胞S期阻滞[21]。细胞周期的进展和停滞过程与肾损伤后肾脏的恢复和纤维化密切相关。p21蛋白(CDKN1a)是细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)的抑制剂，在凋亡过程中发挥重要作用，可依赖或非依赖于p53蛋白的控制[21]。目前，p21蛋白介导的细胞周期阻滞在黏菌素诱导的肾毒性中发挥的作用尚不清楚，仍有待进一步研究。

2 黏菌素肾毒性的减毒策略

2.1 通过改变黏菌素剂型或抑制细胞摄取降低黏菌素肾毒性 临床中，黏菌素主要用于治疗胞外菌感染，而黏菌素诱导肾毒性的直接原因是肾细胞内药物浓度过高，超过耐受阈值。因此，不减少血药浓度及其杀菌活性的情况下，降低真核细胞内的黏菌素药物浓度是有效的减毒策略之一。目前，临床已经采取雾化给药方式治疗肺部感染，从而达到降低黏菌素系统毒性的目的[22]。还有一些研究通过抑制黏菌素的受体活性改善黏菌素的细胞内摄取，从而达到降低黏菌素肾毒性的目的[23]。多个研究证实，内源性受体巨蛋白(MR)、多肽转运蛋白1(PEPT1)及有机阳离子转运蛋白1(OCTN1)是多黏菌素类药物进入细胞内的关键转运蛋白[23-25]。动物模型发现，细胞色素C(CytC)可通过抑制MR活性明显改善多黏菌素B诱导的大鼠肾毒性[26]。离子通道转运蛋白抑制剂糖蛋白预处理也可改善黏菌素诱导的细胞凋亡及肾脏损伤[27]。然而，由于这些受体自身也具有重要的生物学功能，受体抑制剂的使用导致对其他功能的损伤，在一定程度上限制了其临床应用。

2.2 抗氧化剂抑制黏菌素肾毒性 基于上述的氧化应激损伤理论，开发有效的抗氧化剂是目前针对黏菌素肾毒性的重要减毒策略之一。多项研究通过小鼠及大鼠模型研究证实，传统的抗氧化剂，如维生素C、维生素E、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、褪黑素和α-硫辛酸，这些药物自身具有较强的抗氧化功能，用药后能够部分改善黏菌素诱导的肾脏组织氧化应激损伤和细胞凋亡，从而改善黏菌素诱导的肾毒性[7,10,28-33]。然而，临床研究显示，维生素C的使用未能有效改善黏菌素临床应用的肾毒性，这提示传统的抗氧化剂仅在动物模型上具有一定的保护效果，主要原因可能与动物模型使用剂量远高于临床实际使用剂量或二者之间的生理差异相关[33]。此外，维生素C与黏菌素同时给药可能影响黏菌素的药动学，也可能抑制黏菌素的抗菌活性，因而在临床应用上极其受限。

2.3 激活Nrf2/HO-1信号通路改善黏菌素肾毒性 Nrf2是细胞内最重要的调控抗氧化应激损伤的转录因子之一，Nrf2激活可促进其下游抗氧化元件(ARE)相关基因的表达，如促进HO-1、SOD和GSH-Px的表达。这些基因的激活常常可通过清除细胞内ROS水平，达到抑制氧化应激损伤和细胞凋亡，从而改善黏菌素肾毒性的目的。如Dezoti Fonseca等[16]研究发现，HO-1诱导剂血红素能够增加肾脏组织内过氧化氢酶活性，保护多黏菌素B诱发的小鼠肾毒性。本课题组先前的研究证实，小鼠口服补充番茄红素20 mg/(kg·bw·d)、黄芩素100 (kg·bw·d)或姜黄素200 (kg·bw·d)，连续7 d，均可有效激活Nrf2/HO-1信号通路，从而改善黏菌素诱导的氧化应激损伤及肾毒性[25,34]。值得注意的是，这些天然活性物质往往具有较高的临床安全性，且来源较为丰富，价格相对低廉，在兽医临床更具有应用价值。此外，一些化合物，如姜黄素，还可有效改善黏菌素诱导的神经毒性，协同黏菌素体外杀菌，逆转耐药菌对黏菌素的敏感性，具有较强的临床开发价值[25]。

3 总结与展望

黏菌素已成为临床治疗多重耐药革兰阴性细菌造成感染的最重要的抗菌药物之一。肾毒性是黏菌素临床应用的主要毒副作用，严重限制其剂量应用及临床治疗指数。同时，越来越多的研究表明，增加当前推荐的临床治疗剂量可能会达到更好的治疗效果，并且可降低临床细菌产生适应性耐受的风险，但增加剂量往往会增加其肾毒性和神经毒性。经过十余年的研究，关于黏菌素肾毒性的分子机制已经取得了一定的进展，已经证实黏菌素可诱导细胞氧化应激、凋亡及自噬，而氧化应激损伤在黏菌素肾毒性过程中发挥重要作用，抑制氧化应激能够在一定程度上缓解黏菌素诱导的细胞死亡和肾毒性。同时，研究也发现，PI3K/Akt、NF-κB、Nrf2/HO-1、MAPK、p53及p21等多个信号通路参与调控黏菌素诱导肾毒性。然而，尚不清楚这些信号通路在黏菌素肾毒性过程中的内在联系，它们如何影响氧化应激，如何调控细胞自噬及凋亡，是否可以作为靶点来抑制黏菌素肾毒性，这些问题均亟待解决，对降低黏菌素的肾毒性，开发有效的减毒策略，提高临床治疗指数具有重要的科学意义。