金莲花白粉病病原菌鉴定△

李勇，王蓉，丁万隆

中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193

金莲花Trollius chinensisBge.为毛茛科金莲花属多年生草本植物，始载于《本草纲目拾遗》，富含黄酮类、有机酸类、生物碱类、香豆素类化学成分，具有明显的清热解毒、抗菌消炎等药理活性[1]，对咽炎、急慢性扁桃体炎、急性中耳炎、急性结膜炎、急性骨膜炎、上呼吸道感染等有较好临床疗效[2-3]。金莲花片、金莲花口服液、金莲花胶囊、金莲花颗粒和金莲花润喉片被《中华人民共和国药典》2020年版收录[4]。目前，中药材市场上销售的金莲花主要依赖人工栽培。河北省承德、张家口地区作为我国药用金莲花的主产区，集约化、大规模人工栽培为金莲花病菌繁衍创造了有利条件，导致以前零星发生的病害逐渐上升为主要病害，且为害逐年加重，对金莲花种植业构成较大威胁。

笔者2018 年在河北省围场县调查发现，3 年生金莲花植原体病的发生率达20%～30%[5]，而白粉病发病率则高达60%，对金莲花植株生长、种子及花的产量和品质均造成严重影响，但迄今未见有关金莲花白粉病的病原菌记录及研究报道。为此，本研究在基地调研基础上，结合病害发生及为害特征、病菌显微形态学观察及核糖体脱氧核糖核酸（rDNA）-内转录间隔区（ITS）序列比对分析，开展了金莲花白粉病的病原鉴定工作，为深入开展金莲花白粉病菌的生物学研究及病害综合防控提供参考。

1 材料

1.1 样品

3 年生金莲花白粉病病株于2018 年8 月采自河北省承德市围场县金莲花人工种植基地（E116°16′2.567″，N40°1′59.998″），由中国医学科学院药用植物研究所丁万隆研究员鉴定为金莲花Trollius chinensisBge.。采集的金莲花白粉病样品带回实验室，用于后续开展金莲花白粉病病原菌鉴定工作。

1.2 仪器

XSP-12CA 型生物显微镜（上海光学仪器厂）；T100™型热循环聚合酶链式反应（PCR）扩增仪（Bio-Rad 公司）；DYY-6C 型电泳仪（北京市六一仪器厂）。

1.3 试药

TaqDNA 聚合酶（日本TaKaRa 公司）；真菌基因组DNA 提取试剂盒（美国Omega 公司）；DNA 凝胶回收试剂盒（北京汇天东方生物技术有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 病原菌形态学观察

取载玻片1张，中央加入无菌水1滴。小心取出金莲花白粉病样本，用无菌手术刀片从金莲花茎秆或叶片上刮取少量白粉菌，放入无菌水中，轻轻盖上盖玻片，显微镜下观察白粉菌闭囊壳、子囊、子囊孢子及附属丝形态特征。

2.2 病原菌分子鉴定

用无菌手术刀片从金莲花白粉病株的茎秆、叶柄及叶片上小心刮取白粉菌0.1 g，转入事先冷却的1.5 mL 离心管中，液氮冷却下充分研磨。白粉菌基因组DNA 用真菌基因组DNA 提取试剂盒提取，具体提取步骤参照试剂盒说明。白粉菌rDNAITS 区段扩增引物ITS1/PM6 用于供试白粉菌基因组DNA 样本扩增[6]。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测及DNA 凝胶回收试剂盒纯化后，交北京擎科新业生物技术有限公司测序。相关序列在美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站经BlastN 程序与GenBank 已知白粉菌序列进行比对，MegaX 软件邻接法（neighbor-joining methods，NJ）构建系统发育树。

3 结果与分析

3.1 病害症状

白粉病每年7 月中旬至9 月上旬在金莲花产区流行，成株期金莲花发病较重。病害发生初期，金莲花茎秆、叶柄及叶片局部出现白色粉状霉层，茎秆及叶片颜色无明显变化（图1）；随病情发展，被霉层覆盖的部位开始出现黑褐色病斑，不规则形，并逐渐串联成片（图2）；最终，霉层转为浅褐色，上面密布白粉菌闭囊壳（图3）。白粉病为害轻则造成金莲花减产，严重者造成金莲花早衰甚至死亡。

图1 金莲花茎秆上的菌丝层

图2 金莲花茎秆上的菌丝及闭囊壳

图3 金莲花叶片及植株基部为害状

3.2 病原菌形态特征

金莲花白粉菌闭囊壳聚生，暗褐色，近球形，直径为60～100 μm，壁细胞不规则多角形，有凸起；每个闭囊壳内仅有1个子囊，内含8个浅褐色、卵圆形的子囊孢子（图4）；附属丝多根，着生于子囊果一侧，菌丝状，浅褐色，有隔膜，直径为4～6 μm（图5）。

图4 金莲花白粉菌闭囊壳

图5 金莲花白粉菌闭囊壳及附属丝结构

3.3 病原菌分子鉴定

经ITS 引物扩增，得到1 条长485 bp 条带（GenBank登录号：MT956681）。BLAST分析结果表明，金莲花白粉菌ITS 扩增序列与叉丝单囊壳属白粉菌Podosphaera fuliginea（MF543026、AB046986）的序列同源性最高，分别为98.88%、98.73%。与P.gunnerae（AB525924、AB525923）序列同源性也较高，分别为98.03%、97.77%。此外，与叉丝单囊壳属P.fuliginea（MK779060、MT261949 等）、P.plantaginis（KY661120、KY661084、KY660808等）、P.xanthii（MN203658、MG647819等）、P.fusca（MT985559、AY739113、KJ438824等）、P.erigerontiscanadensis（KY661158、KY661089、KY661039 等）、P.macrospora（KY661098、KY661097、KY661099等）的同源性也超过96%。将上述同源菌株基于rDNA-ITS序列构建系统发育树，供试金莲花白粉菌与叉丝单囊壳白粉菌P.fuliginea聚为一支（图6）。结合供试白粉菌闭囊壳、子囊等的显微形态特征，将其鉴定为叉丝单囊壳P.fuliginea。

图6 金莲花白粉菌及其同源菌株基于rDNA-ITS序列构建的系统发育树

4 讨论

白粉菌为植物专性寄生菌，属子囊菌门（Ascomycota）白粉菌目（Erysiphales），新分类系统包括1 科15 属650 余种[7]。白粉菌家族成员众多，分类系统复杂，且在属、种水平的分类上常有变化。白粉菌寄主范围、专化性、闭囊壳内子囊及子囊孢子数目，特别是闭囊壳外附属丝形态特征一直是白粉菌鉴定的重要依据[8-9]。随着分子生物学及电镜在系统进化研究中的应用，白粉菌属级分类系统及进化理论发生了重大变化。无性型形态特征逐渐成为白粉菌属分类的重要依据，闭囊壳外附属丝形态在白粉菌属级分类中不再重要，但仍可作为种级分类的参考依据[10-11]。

真菌rDNA-ITS序列在真菌种内既有高度的保守性，又存在丰富的种属间变异。根据该特性，上述序列不仅能用于真菌纯培养的分子鉴定，还可用于病原真菌及环境真菌群体的动态监测[12-13]。利用专用引物扩增白粉菌基因组ITS 区段，结合核酸序列同源性分析，同样适用于白粉菌属病原的分类鉴定研究[14-15]。

近年来，白粉病逐渐上升为金莲花生产上的主要病害之一，导致罹患白粉病的金莲花产量和品质明显下降，对金莲花种植业威胁较大。由叉丝单囊壳P.fuliginea引起的白粉病在新疆碎花婆婆纳[16]、大波斯菊和黄瓜[17]、多肉长寿花[18]等植物上亦有报道。野生金莲花上未见白粉病发生，推测栽培金莲花白粉病系邻近寄主或跨区传播导致。

田间调查发现，金莲花种植密度过大，局地小气候相对湿润，可能是造成金莲花白粉病严重发生的主要原因，在金莲花生产上应引起足够重视。金莲花以花入药，病害高发时期与花盛开期部分重叠。因此，金莲花生产上白粉病防治，应在加强田间管理前提下，尽可能在病害发生初期喷施高效、低毒、低残留化学杀菌剂[19-20]或微生物制剂加以预防，且严格控制用药次数和使用剂量。