QuEChERS结合UHPLC-MS同时测定土鳖虫及其成方制剂中9种真菌毒素含量△

李媛，张楠，张亚锋，孙晓，张苗苗，谢志民

西安市食品药品检验所，陕西 西安 710054

真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，属于中药微量外源性的有害残留物。真菌毒素包含曲霉属（黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A 等）、镰刀菌属（玉米赤霉烯酮、T-2毒素、呕吐毒素和伏马毒素等）和青霉属（展青霉素和桔青霉素等）。中药在采集、贮藏、制备、运输过程中如保存不当极易受潮霉变，部分品种有污染真菌毒素的可能，尤其是种子、果实类中药、发酵类中药、动物药及含有上述中药的中成药[1-3]。动物药基质以蛋白质、脂肪、核酸等大分子为主，基质营养丰富，容易霉变。动物药污染的主要途径应该是贮存过程。目前，多数动物药并未明确规定冷藏、防潮等贮藏条件，霉变的样品在市场上多见[4]。真菌毒素的前处理方法包括提取和净化2 种，提取方法主要有高速均质提取法、振荡提取法、超声提取法、高速搅拌提取法等，净化方法主要有免疫亲和柱色谱法、固相萃取柱色谱法和QuEChERS[5-6]。目前，QuEChERS 在食品中应用较广泛，但在中药真菌毒素的研究方面报道较少，相较于其他方法，其具有操作简便快捷、价格低廉的特点。本研究初步采用QuEChERS 测定中成药中的真菌毒素。真菌毒素的检测方法有薄层色谱法、酶联免疫色谱法、高效液相色谱法和液相色谱质谱联用法等[7-9]。QuEChERS 相较于免疫亲和柱色谱法除杂效果欠佳，干扰较多，因此，采用液相色谱质谱联用的多反应监测模式，可有效排除杂质干扰，而且灵敏度高。

土鳖虫Eupolyphaga Steleophaga 为鳖蠊科昆虫地鳖或冀地鳖的雌虫干燥体，有破血逐瘀、续筋接骨的功效，用于跌打损伤、筋伤骨折、血瘀经闭、产后瘀阻腹痛、症瘕痞块[10]。余诗琪等[11]采用固相萃取-液质联用法测定了土鳖虫中12种真菌毒素。孙岚等[12]采用免疫亲和柱净化-高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法测定了土鳖虫中的黄曲霉毒素。尚未有文献报道采用QuEChERS 测定土鳖虫及其制剂中的黄曲霉毒素。而《中华人民共和国药典》2020 年版四部“中药中真菌毒素测定指导原则”项下说明：“处方中含有易污染的药材以及生粉投料的中成药品种应注意相关真菌毒素的检测”，因此，本实验同时检测了土鳖虫及其制剂中的真菌毒素。

本研究通过QuEChERS 净化，超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS）检测，建立了土鳖虫及其成方制剂中黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1（AFG2、AFG1、AFB2、AFB1），伏马毒素B1、伏马毒素B2（FB1、FB2），赭曲霉毒素A（OTA），玉米赤霉烯酮（ZON），T-2 毒素共9种真菌毒素的检测方法。

1 材料

1.1 仪器

LC-30 AD 型超高效液相色谱仪、LCMS 8060型三重四极杆质谱仪、LabSolutions工作站（日本岛津公司）。

1.2 试药

乙腈（色谱纯，Fisher 公司）；甲酸（色谱纯，上海阿拉丁试剂有限公司）；氯化钠、无水硫酸镁（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；N-丙基乙二胺粉（PSA）、石墨化炭黑粉（GCB）、十八烷基硅烷粉（ODS）均购于天津博纳艾杰尔公司。AFG2、AFG1、AFB2、AFB1混合对照品溶液（质量浓度为10 μg·mL-1，批 号：ALT060109）购 于Achemtek 公司；FB1、FB2混合对照品溶液（质量浓度分别为 59.13、52.15 μg·mL-1，批号：SSFBa005）购于Fermentek 公司；OTA、T-2 毒素、ZON 对照品溶液（质量浓度均为100 μg·mL-1，批号分别为1G01BC5、1700710、1G01J30）均购于Pribolab公司，纯度均高于99.0%。

土鳖虫（批号：183J160501）、活血止痛胶囊（批号：19050156）、通心络胶囊（批号：A1812016）、腰痛宁胶囊（批号：920200）、复方三七胶囊（批号：171103）、麝香接骨胶囊（批号：2000101）、伤科接骨片（批号：20191110）均购自陕西省西安市某药店。土鳖虫经西安市食品药品检验所中药室谢志民主任药师鉴定为鳖蠊科昆虫地鳖Eupolyphaga sinensisWalker的雌虫干燥体。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

称取土鳖虫粉末及其成方制剂约5 g，分别置于50 mL离心管中，加水10 mL，浸润摇匀，加入10%甲酸乙腈溶液10 mL，涡旋混匀1 min，加入氯化钠1 g、无水硫酸镁4 g，涡旋混匀1 min，在4000 r·min-1条件下离心5 min（离心半径10 cm）。精密量取上清液5 mL，加入无水硫酸镁900 mg、PSA 100 mg，涡旋混匀1 min，在4000 r·min-1条件下离心5 min（离心半径10 cm）。精密量取上清液2 mL，减压浓缩至干，加入50%乙腈1 mL复溶，用0.22 μm 有机系微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密吸取对照品溶液适量，用50%乙腈配制成质量浓度为20 ng·mL-1的AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、OTA、FB1、FB2，40 ng·mL-1的T-2 毒素、ZON混合对照品溶液。

2.3 仪器分析条件

2.3.1超高效液相色谱条件 色谱柱：赛默飞Acclaim RSLC 120 C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.2 μm）；柱温：35 ℃；进样体积：1 μL；流动相：0.1%甲酸水溶液（A），乙腈-甲醇（B，1∶1），梯度洗脱（0～5 min，40%～50%B；5～6 min，50%～60%B；6～12 min，60%～65%B）；流速：0.3 mL·min-1。

2.3.2质谱条件 电离方式：电喷雾离子源（ESI），ZON采用负离子模式（ESI-）采集，其余均用正离子模式（ESI+）采集；检测方式：多反应检测（MRM），分析参数见表1；雾化气流量：3.0 L·min-1；加热气流量：10.0 L·min-1；干燥气流量：10.0 L·min-1；接口温度：300 ℃；脱溶剂管温度：250 ℃；加热块温度：400 ℃。

2.3.3监测离子的选择 采用SCAN 模式以m/z150～400进行扫描，9种真菌毒素的离子参数见表1。

2.4 方法学验证

2.4.1校准曲线、线性关系和检出限（LOD）、定量限（LOQ）将对照品溶液逐级稀释，配制系列混合对照品溶液，以各化合物的质量浓度和响应值峰面积绘制标准曲线，混合对照品溶液色谱图见图1。结果表明，9 种真菌毒素在各自质量浓度范围内线性关系良好，r≥0.995 6。以信噪比（S/N）为3时，各化合物的定量离子对对应的样品质量浓度计算LOD。以S/N 为10 时，各化合物的定量离子对对应的样品浓度计算LOQ。结果见表2。

表2 土鳖虫9种真菌毒素的线性方程和LOD、LOQ

图1 土鳖虫中9种真菌毒素TIC图

2.4.2重复性试验 精密称取土鳖虫样品5 g，以5 μg·L-1水平添加，按2.1项下步骤进行前处理，平行检测6次，RSD＜10%，重复性良好。

2.4.3稳定性试验 分别于0、1、4、8、12、16、20、24 h 精密吸取重复性考察项同一供试品溶液，以5 μg·L-1水平添加，按2.1项下步骤进行前处理，按上述条件测定9 种真菌毒素的峰面积，结果峰面积的RSD 均≤10%，表明供试品溶液中9 种真菌毒素在24 h内均稳定。

2.4.4准确度和精密度试验 以加样回收率评价方法的准确度和精密度，添加低、中、高3 种不同质量浓度水平（1、5、10 μg·L-1）的9 种真菌毒素混合对照品溶液，按照2.1项下方法制备，每个质量浓度水平进行3 份平行测定分析，平均回收率为70.42%～101.28%，RSD＜12%，符合样品分析检测要求。结果见表3。

表3 土鳖虫9种真菌毒素加样回收率测定结果%

2.5 样品测定

采用所建立的检测方法，分别对土鳖虫及活血止痛胶囊、通心络胶囊、腰痛宁胶囊、麝香接骨胶囊、复方三七胶囊和伤科接骨片等成方制剂中的真菌毒素进行分析检测，结果见表4。

表4 土鳖虫及其成方制剂中9种真菌毒素含量的测定结果μg·kg-1

3 讨论

3.1 流动相的选择

分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水流动相系统，并且考察了不同浓度甲酸效果，结果乙腈-甲醇（1∶1）-0.1%甲酸水溶液系统出峰时间快，峰形好且灵敏度较高。故选择乙腈-甲醇（1∶1）-0.1%甲酸水溶液为流动相。

3.2 提取溶剂的选择

目前，常用的毒素提取溶剂包括甲醇、乙酸乙酯、乙腈和水中的1种或者多种不同配比的混合物，本实验比较了甲醇-水、乙腈-水、10%甲酸-乙腈提取效果，10%甲酸-乙腈得到的真菌毒素离子对峰形较好且较为稳定。综合考虑选择10%甲酸-乙腈作为提取溶剂。

3.3 净化方式的选择

本实验基于QuEChERS，考察了PSA、GCB、ODS 及无水硫酸镁4 种吸附填料用量与配比对实验的影响。以回收率为指标，结果表明，采用PSA-无水硫酸镁（150∶900）净化效果最好，且回收率能满足实验要求。

4 结论

本研究建立了土鳖虫药材及含土鳖虫的成方制剂中AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、FB1、FB2、OTA、ZON 及T-2 毒素的检测方法，该法简便、快速、准确，能用于土鳖虫药材及制剂中真菌毒素的控制。实验结果表明，除麝香接骨胶囊外其余品种均检出不同类型及含量的真菌毒素，经查阅相关国内和国际真菌毒素的限量标准，国内只有《中华人民共和国药典》2020 年版对药材有限量规定，国际标准中大部分均是针对食品的限量标准，而成药中真菌毒素限量还需要进一步深入研究，为含易霉变土鳖虫药材及含土鳖虫的成方制剂中药的安全使用提供保障。