鸡胗中百菌清及其代谢物残留量检测

陈美君 左海根 刘小玉 张德继 王和雨 杜永琴 黄英杰

摘要 [目的]建立一种能同时检测鸡胗中百菌清及其代谢物4-羟基百菌清残留量的测定方法。[方法]鸡胗试样与无水硫酸钠混合后充分研磨，乙腈提取，浓缩定容后采用液相色谱仪测定。[结果]百菌清及其代谢物4-羟基百菌清在该色谱条件下得到很好的分离，百菌清和4-羟基百菌清浓度在0.05～1.00 mg/L呈较好的线性（R2>0.999）。添加水平为0.02～0.08 mg/kg时添加回收率为74%～106%，相对标准偏差为1.6%～16.3%，方法定量限均为0.02 mg/kg。[结论]该方法具有样品前处理简单快速、灵敏度高、检测成本低的特点，可应用于鸡胗中百菌清及其代谢物4-羟基百菌清残留量的检测。

关键词 百菌清;4-羟基百菌清;代谢物;残留;液相色谱仪

中图分类号 TS 207.5+3  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）03-0201-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.053

Detection of Chlorothalonil and Its Metabolite Residues in Gizzards

CHEN Mei-jun， ZUO Hai-gen， LIU Xiao-yu et al

（School of Chemistry and Food Science， Nanchang Normal University， Nanchang，Jiangxi 330032）

Abstract [Objective]To establish a method for the determination of chlorothalonil and its metabolite 4-hydroxychlorothalonil residues in gizzards.[Method]The gizzards sample was grinded with anhydrous sodium sulfate， extracted with acetonitrile， and detected by high performance liquid chromatography with UV detector.[Result] Chlorothalonil and 4-hydroxychlorothalonil were good in linear relationship between 0.05 -1.00 mg/L（R2>0.999）. When the addition levels were 0.02-0.08 mg/kg， the recovery rates were 74%-106%， the relative standard deviations were 1.6%-16.3%， and the method quantification limits were 0.02 mg/kg.[Conclusion]The method has the characteristics of simple and rapid sample pretreatment， high sensitivity and low detection cost， and can be applied to the detection of the residual amount of chlorothalonil and its metabolite 4-hydroxychlorothalonil in gizzards.

Key words Chlorothalonil;4-hydroxychlorothalonil;Metabolites;Residues;Liquid chromatography

基金項目 南昌师范学院2019年学生科研项目（19XSKY44）;南昌师范学院2021年学生科研项目（21XSKY47）;南昌师范学院博士基金项目（NSBSJJ2019001）。

作者简介 陈美君（2001—），女，四川威远人，从事食品安全研究。通信作者，副教授，博士，从事食品安全检测研究。

收稿日期 2021-09-13

随着人民物质生活的不断提高，食品安全问题备受关注。鸡胗因肉质厚实，深受人们的喜爱。鸡胗是鸡的砂囊，主要功能是储存和磨碎食物，极易吸收食物中的药物残留，因而监测鸡胗中药物残留量显得十分必要。

百菌清是一种非内吸性广谱杀菌剂，对多种作物的真菌病害具有防治作用，主要通过与真菌细胞中的3-磷酸甘油醛脱氢酶发生反应，酶体中含有半胱氨酸的蛋白质被结合，丧失酶的活性，使真菌细胞的新陈代谢遭到破坏而失去生命力[1]。百菌清对生物具有一定的毒性[2-4]。尤其是百菌清在环境中易被代谢为4-羟基百菌清，其毒性约为百菌清母体的30倍[3]。另外，4-羟基百菌清的迁移性、持久性较母体也有明显增加[5-6]。基于百菌清对环境构成的潜在威胁，被美国国家环境保护总署列为可能使人类致癌的物质之一[7-8]。我国的国家标准GB 2763—2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》对食品中百菌清和4-羟基百菌清的最大允许残留限量进行了严格规定，禽类内脏中百菌清（以4-羟基百菌清计）的最大残留限量为0.07 mg/kg。

当前人们对百菌清残留量的分析技术开展了较深入的研究，但主要集中于百菌清母体的检测[9-14]。对于百菌清及其代谢物残留检测技术的报道较少，主要包括免疫分析法[15-16]、高效液相色谱法（HPLC）[17]、气相色谱法（GC）[18]、气相色谱质谱法（GC-MS）[19]和液相色谱质谱法 （HPLC-MS）[19-21]。当前百菌清及其代谢物残留量检测还主要集中在环境及植物源食品中检测[15-21]，但应用于禽类内脏的检测方法以及百菌清在动物体内代谢规律研究鲜见报道。笔者将建立同时检测家禽中百菌清及4-羟基百菌清残留量的检测方法，为后续开展百菌清在家禽体内代谢规律研究奠定基础，也为保障家禽产品的安全提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试材

乙腈（液相色谱级，美国TEDIA公司）;无水硫酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）;百菌清标准品（100 mg/L，中国环境监测站）;4-羟基百菌清标准品（纯度99.7%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）;针孔滤膜（有机相0.45 μm）;试验用水为超纯水。鸡胗试样（购于南昌某超市）。

4-羥基百菌清标准储备溶液（100 mg/L）：准确称取10 mg 4-羟基百菌清标准品，用乙腈溶解并定容至100 mL，冰箱中避光保存。

混合标准溶液（1 mg/L）：分别移取1 mL百菌清标准溶液（100 mg/L）和4-羟基百菌清（100 mg/L）于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，冰箱中避光保存。

1.2 仪器

Waters 1525-2489液相色谱仪，包括四元泵、在线真空脱气机、柱温箱、自动进样器和紫外检测器（UV）;QL-902漩涡混合器;HY-8调速振荡器;RE-2000A旋转蒸发器;移液枪;NC-BY20超纯水装置。

1.3 色谱条件

安捷伦公司TC C18色谱柱（150 mm×4.8 mm，5 μm）;柱温25 ℃，进样量10 μL;紫外检测器波长243 nm;流动相为乙腈-水，梯度洗脱条件见表1。

1.4 试验方法

将鸡胗剪成小块，用刀式研磨仪搅碎混匀。准确称取鸡胗试样5.0 g于研钵中，加入30 g无水硫酸钠，研磨至干粉状。将研磨好的试样转移至250 mL锥形瓶中，加入40 mL乙腈溶液，在振荡仪上振荡15 min后，静置分层，将上层液过无水硫酸钠柱后收集于250 mL浓缩瓶中。残渣中再加入20 mL乙腈重复提取2次，合并上清液后在40 ℃水浴中旋转浓缩至干。准确移取2 mL乙腈于浓缩瓶中，涡旋溶解后过有机相针孔滤膜，供液相色谱仪测定。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件选择

为了比较不同的提取溶剂对鸡胗中百菌清、4-羟基百菌清的提取效率的影响，采用比较不同提取溶剂（乙腈、乙酸乙酯、正己烷）对目标化合物的提取效率。研究表明，乙腈提取效率最佳，这是由于4-羟基百菌清具有一定的极性，更适合用乙腈提取。另外乙腈具有穿透性强、提取杂质少的特点，该研究选择乙腈作为提取溶剂，这与相关的报道一致[22]。

为了进一步提高4-羟基百菌清的提取效率，对提取方式进行了选择和优化，结果表明，样品与无水硫酸钠混合研磨除水后，再采用乙腈提取，4-羟基百菌清和百菌清具有较好的提取效率。这是因为剧烈的研磨过程能进一步破坏鸡胗的组织结构，有助于乙腈的提取，而且能有效除去组织中的水分。

2.2 检测条件的选择

2.2.1 色谱柱的选择。

为了选择较佳的色谱柱，对不同的色谱柱进行标准品检测，根据目标化合物的峰形和响应值选择最佳的色谱柱。百菌清及其代谢物属于极性较小的化合物，因此采用弱极性色谱柱进行分析，结果表明不同型号的色谱柱对分离存在一定的差异。该研究分别采用色谱柱1（Agilent TC C18，150 mm×4.8 mm，5 μm）和色谱柱2（Kromasil NH2，250 mm×4.8 mm，5μm）进行分离，结果表明，色谱柱1能将百菌清及其代谢物4-羟基百菌清有效分离，峰形好，灵敏度高;而色谱柱2不能有效分离，不适合作为分离色谱柱。因而选择色谱柱1作为分离柱。

2.2.2 流动相的选择。

考察了乙腈-水、甲醇-水作为流动相时对百菌清及其代谢物色谱行为的影响，结果表明，乙腈-水作为流动相的响应值较高，故选用乙腈-水作为流动相。另外，流动相的比例对目标物的分离也有较大的影响，结果见图1。

从图1可以得出，当采用等比例的流动相洗脱时，当乙腈的初始含量为70%，目标物虽然能达到基线分离，峰形较好，但保留时间较小。随着乙腈含量的进一步增加，色谱峰型变差。因而该研究采用梯度洗脱方式，得到较好的峰型和较高的灵敏度（图1e）。

2.2.3 检测波长的选择。

首先研究了百菌清和4-羟基百菌清的最大吸收波长，发现这2种化合物的最大吸收波长不一致，分别为243和233 nm，综合考虑，选择243 nm作为检测波长。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系及定量限。

配制0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L的系列标准溶液。按照“1.3”色谱条件进行测定后，得到百菌清和4-羟基百菌清均呈现较好的线性，线性决定系数（R2）分别为0.999 9和0.999 8。试验以10倍信噪比计算定量限，得到鸡胗样品中百菌清和4-羟基百菌清的定量限均为0.02 mg/kg。

2.3.2 回收率和精密度。

在阴性鸡胗样品中分别添加0.02、0.04和0.08 mg/kg，百菌清的回收率为74%～84%，精密度为3.0%～10.5%;4-羟基百菌清的回收率为86%～106%，精密度为1.6%～16.3%。鸡胗样品测定对应的标准品、空白、样品和样品添加的液相色谱图见图2。

3 结论

该研究建立了一种同时检测鸡胗中百菌清及其代谢物4-羟基百菌清残留量的测定方法，该方法前处理简便、回收率稳定、测定结果准确、成本低廉，可用于鸡胗中百菌清及其代谢物4-羟基百菌清残留量的检测，为鸡胗中百菌清及其代谢物残留量监测提供一定的技术支持。

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