乙酰水杨酸-异烟肼的包合工艺优化与抗菌活性测试

方世通，祝 宏，金学平，丁 娇，马 峻，王艳武，刘 慧*

1.武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430205；2.武汉市药物增溶工程技术研究中心（武汉软件工程职业学院），湖北 武汉 430205；3.武汉市金银潭医院，湖北 武汉 430023

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的，近年带有多重耐药性的结核杆菌（multidrug resistance-mycobacterium tuberculosis，MDR-MTB）日益增加［1］，其惊人增长加剧了其全球流行。MDR-MTB的高发病率可能极大地阻碍当前的结核病治疗，导致更高的失败率、更长的治疗时间和更复杂的药物方案。目前，结核病的化疗包括几种治疗方案，MDR-MTB的治疗可延长至2年［2］。一般结核病治疗通常使用的抗生素有利福平、异烟肼［3］、吡嗪酰胺、乙酰水杨酸［4］和乙胺丁醇［5］。但随着抗生素的滥用，以及耐药性的日益增强，为了对抗耐药性，除了其他药物取代，还可以将不同药物杂合在一起，比如将异烟肼和乙酰水杨酸通过一些简单的烷烃链等共价键连接起来，得到乙酰水杨酸-异烟肼杂合药物［6］，期望改善单一作用靶点的异烟肼和乙酰水杨酸药物分子的耐药性［7］。

并且，为了方便临床用药，提高药物制剂的靶向性，选择用包合的方式，将所得药物分子利用糖类材料包合保护起来，其中，糖类材料选择了β-环糊精和壳聚糖。

β-环糊精是由7个吡喃葡萄糖分子组成环状结构的环状低聚糖，这些亚基通过1，4糖苷键连接。环糊精具有环形形状，环形的较大和较小的开口分别暴露于溶剂仲羟基和伯羟基。由于这种排列，环的内部不是疏水性的，但比水性环境亲水性要低得多，因此能够容纳其他疏水性分子。相反，外部足够亲水以赋予环糊精（或其复合物）水溶性。它们不溶于典型的有机溶剂。具有疏水性分子的环糊精包合物能够穿透人体组织，这些可用于在特定条件下释放生物活性化合物，有着广泛的应用［8-10］。

壳聚糖（chitosan）是直链多糖随机分布的β-（1→4）-linked-D-glucosamine（脱乙酰单元）和Nacetyl-D-glucosamine（乙酰化单元）。壳聚糖可用于帮助通过皮肤输送药物，壳聚糖能增强极性药物跨上皮表面的转运，且具生物相容性和可生物降解性［11］，以及可能存在的叠加抗菌作用［12］。

本文通过使用β-环糊精、壳聚糖来包合抗结核杂合药物乙酰水杨酸-异烟肼（acetylsalicylic acid-isoniazid，ASA-INH），结构式如图1所示，得到对应的ASA-INH-β-环糊精包合物、ASA-INH-壳聚糖包合物，通过实验得出包合的最优工艺，并且对该包合物进行了表征实验，以及检测包合物对结核杆菌的抗菌活性。

图1 ASA-INH结构式Fig.1 Structure of ASA-INH

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

实验过程中所用到的主要原料、试剂有：ASA-INH（实验室自制）、乙酰水杨酸（麦克林试剂，acetylsalicylic acid，ASA）、异烟肼（天津市博迪化工有限公司，isoniazid，INH）、壳聚糖（麦克林试剂）、无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司）、冰醋酸（国药集团化学试剂有限公司）、β-环糊精（武汉远成共创科技有限公司）、DMSO（国药集团化学试剂有限公司）、Tween-80（国药集团化学试剂有限公司）、氯化钠（福晨化学试剂有限公司）、树脂天青（麦克林试剂）、7H9培养基（武汉市金银潭医院）。

实验过程中所用到的主要仪器有：数显磁力控温搅拌器（巩义予华仪器有限公司）；Nicolet 5700型傅里叶红外光谱仪（美国尼高力仪器公司）；SII DSC 6220差示扫描量热仪（日本精工株式会社）；WFZ-26A紫外可见分光光度计（武汉圣利兴科技有限公司）。

1.2 乙酰水杨酸-异烟肼包合物的制备

1.2.1 饱和水溶液法制备乙酰水杨酸-异烟肼-β-环糊精包合物 称取0.3 g ASA-INH，加入5 mL无水乙醇，使其溶解，滴入β-环糊精饱和溶液中，该饱和溶液用1.0 gβ-环糊精制备，搅拌30 min后，在0～4℃中冷藏24 h，抽滤，用少量无水乙醇去洗涤未被包合的ASA-INH，剩余物经过真空干燥，即得ASA-INH-β-环糊精包合物。

1.2.2 冷冻干燥法制备乙酰水杨酸-异烟肼-壳聚糖包合物 称取1.0 g的ASA-INH，用0.1 mol/L的冰醋酸溶液将其溶解，再称取1.0 g的壳聚糖，同样将其用0.1 mol/L的冰醋酸溶液溶解，将乙酰水杨酸-异烟肼的冰醋酸溶液缓慢滴入壳聚糖的冰醋酸溶液，搅拌30 min后，在0～4℃中冷藏过夜，随后进行冷冻干燥，用少量的无水乙醇，将冷冻干燥后的样品中未被包合的ASA-INH洗去，抽滤，滤饼经真空干燥即得ASA-INH-壳聚糖包合物。

1.2.3 包合物中乙酰水杨酸-异烟肼的含量测定

包合物的包合率、收率分别根据下式进行计算：

因此，还需要得到包合物中ASA-INH的含量，该含量可利用紫外分光光度法进行测定。

先配制并量取适量质量浓度为0.1 mg/mL ASA-INH的乙醇溶液，在200～500 nm的波长范围内进行紫外扫描，最终结果如图2所示，显示ASA-INH最大吸收出现在236 nm。

图2 ASA-INH紫外光谱扫描图Fig.2 Ultraviolet spectrum of ASA-INH

以无水乙醇为空白，并用无水乙醇配置0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL梯 度 质 量 浓 度 的ASA-INH的标准溶液。于236 nm处测定其紫外吸光度值（A）。

以质量浓度（ρ）对吸光度值（A）进行回归，如图3所示作图，得到回归方程：A=11.87ρ+0.003 7（R2=0.999 3）。

图3 ASA-INH紫外标准曲线图Fig.3 Ultraviolet standard curve of ASA-INH

同样以无水乙醇为空白对照，将ASA-INH的包合物用无水乙醇配成质量浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的待测样品，于236 nm处测定其紫外吸光度值，将吸光度值代入ASAINH紫外标准曲线的回归方程中，计算得到包合物中ASA-INH的含量。

1.2.4 均匀实验优化工艺 对同一种材料，同一种制备方式，影响包合常数的因素主要有3种：客分子和主分子的投料比、包合时间、包合温度。

饱和水溶液法制备ASA-INH-β-环糊精包合物，为得到较好的包合率和收率，选择利用均匀设计进行条件筛选，通过对各物质稳定性等性质的考察，最终设置客分子和主分子的投料摩尔比范围在0.5～1.5之间（间隔为0.25），包合时间在0.5～2.5 h之间（间隔设为0.5 h），温度范围在30～70℃之间（间隔设为10℃）。因素水平表见表1，均匀设计试验表见表2。

表1 因素水平Tab.1 Level of factors

表2 均匀实验设计表Tab.2 Uniform experimental design on U 5（53）

冷冻干燥法制备ASA-INH-壳聚糖包合物，设置客分子和主分子的投料质量比范围在1～240之间，包合时间在0.5～2.5 h之间（间隔设为0.5 h），温度范围30～70℃之间（间隔设为10℃）。因素水平表见表3，均匀设计实验安排表同表2。

表3 因素水平Tab.3 Level of factors

2 结果与讨论

2.1 乙酰水杨酸-异烟肼包合物制备工艺条件的优化

以综合评价（综合评价=包合率×0.7+收率×0.3）为指标，表4为饱和水溶液法均匀实验结果采用“IBM SPSSStatistics”软件，通过综合评价（E1）、客分子和主分子的投料摩尔比（X1）、包合时间（Y1）、包合温度（Z1），对结果进行回归分析，得回归方程为E1=66.343+0.397Z1-0.123X1Z1+0.06Z1Y1。

表4 饱和水溶液法均匀实验结果Tab.4 Results of uniform experimental design for saturated aqueous solution method

利用Excel软件的编程解，分析处理该回归方程得最优工艺条件：ASA-INH与β-环糊精摩尔比为0.5∶1，包合温度为70℃，包合时间为2.5 h，综合评价（E1）经回归方程计算得90.9%。

同样以综合评价为指标，表5为冷冻干燥法均匀实验设计结果。

表5 冷冻干燥法均匀实验结果Tab.5 Results of uniform experimental design for freeze-drying method

采取同样的数据分析处理方法，得回归方程为E2=67.902-0.036X2+0.02Z22+0.023Z2Y2，以 及 最优工艺条件：ASA-INH与壳聚糖质量比为1∶1，包合温度为70℃，包合时间为2 h，综合评价（E2）经回归方程计算得81.6%。

2.2 包合物的表征结果

2.2.1 红外光谱法 比较图4中的b与c、e与f可知，2种包合物的红外谱图双键区和指纹区的吸收峰明显少于2种物理混合物，并且于1 675 cm-1的C=O的伸缩振动吸收峰在两种包合物的红外谱图中消失，这是因为发生了掩蔽作用，该作用产生的原因可能是ASA-INH分子进入β-环糊精空腔内，并且壳聚糖和ASA-INH存在分子间作用力，这证明有ASA-INH-β-环糊精包合物、ASA-INH-壳聚糖包合物生成［13］。

图4 红外光谱扫描图：（a）β-环糊精，（b）ASA-INH-β-环糊精包合物，（c）ASA-INH与β-环糊精的物理混合物，（d）壳聚糖，（e）ASA-INH-壳聚糖包合物，（f）ASA-INH与壳聚糖物理混合物Fig.4 Infrared spectrum scan：（a）β-cyclodextrin，（b）ASA-INH-β-cyclodextrin inclusion compound，（c）physical mixture of ASA-INH andβ-cyclodextrin，（d）chitosan，（e）ASA-INH-chitosan inclusion compound，（f）physical mixture of ASA-INH and chitosan

2.2.2 差示扫描量热法 用空白铝箔盒为对照，在0～300℃的温度范围内，扫描速度为20℃/min，得到了ASA-INH、β-环糊精、ASA-INH-β-环糊精包合物、ASA-INH和β-环糊精物理混合物的吸热峰（图5），以及ASA-INH、壳聚糖、ASA-INH-壳聚糖包合物、ASA-INH和壳聚糖物理混合物的吸热峰（图6）。

图5 样品DSC热谱图Fig.5 DSCthermograms of samples

图6 样品DSC热谱图Fig.6 DSC thermograms of samples

由图5和图6可知，ASA-INH在183℃有一吸热峰，应该是其熔点，而2种包合物DSC曲线中并无该峰，并且β-环糊精、ASA-INH-β-环糊精包合物均在118℃处出现吸热峰，壳聚糖、ASA-INH-壳聚糖包合物均在115℃左右处出现吸热峰，证明ASA-INH和β-环糊精、ASA-INH和壳聚糖均已形成包合物［14］，再看到2种物理混合物的DSC曲线中，发现有2个吸热峰，包括原料杂合物的熔点峰，表明该混合物只是简单的混合，并无新物质生成。

2.3 包合物抗菌活性测试

2.3.1 主要试剂配制 分别称ASA、INH、ASAINH、ASA-INH-β-环糊精包合物、ASA-INH-壳聚糖包合物各50 mg，分别用去离子水定容于50 mL的容量瓶中，配成质量浓度为1.0 mg/mL的溶液，其中，实验最大质量浓度设为0.5 mg/mL，并以此往下做对倍稀释。

2.3.2 实验方法 微孔显色法，采用盲法编排测试程序。

2.3.3 实验结果分析 以结核分枝杆菌H37Rv株为标本，通过氧化还原指示剂显色法检测结核分支杆菌的耐药性，药物的敏感性可由指示剂的颜色变化得到［15］。以不加药物的培养基为对照组，红色表示耐药（R），蓝色表示敏感（S）。培养基的显色情况可以反映出不同药物对H37RV生长的影响，药物的最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration，MIC）是培养基显蓝色最低浓度［16］。

根据表6的初步活性数据显示，相对于原料ASA和INH而言，ASA-INH的抗菌最低浓度更低，表明其抗菌活性增强。

表6 药物抗菌活性Tab.6 Antibacterial activities of drugs

本实验选择的杂合物和制备的2种包合物对标准菌株H37RV的MIC值相同，并且发现β-环糊精包合的药物比壳聚糖包合的药物具有更强的抗耐药性和杀菌活性，推测可能是由于载体的亲水性，因此可以限制MarR介导的杂合物外排，从而消除MarR影响，以减少耐药性对其的影响，对于使用壳聚糖包合的，还可能存在一部分的叠加抗菌效应［12］。

3 结 论

本文基于β-环糊精和壳聚糖为包合物载体，采用饱和水溶液法制备ASA-INH-β-环糊精包合物，冷冻干燥法制备ASA-INH-壳聚糖包合物。通过均匀设计，结果表明，ASA-INH与β-环糊精的最佳包合工艺条件为：ASA-INH与β-环糊精摩尔比为0.5∶1、包合温度70℃、包合时间2.5 h，综合评价为90.9%。ASA-INH与壳聚糖的最佳包合工艺条件为：ASA-INH与壳聚糖物质的量比1∶1、包合温度70℃、包合时间2 h，综合评价为81.6%。经抗菌活性测试，ASA-INH-β-环糊精包合物、ASA-INH-壳聚糖包合物的活性比乙酰水杨酸、异烟肼及乙酰水杨酸-异烟肼都有着更低的MIC，并且发现ASA-INH-β-环糊精有着最低的MIC（≤0.052µmol/mL），值得进一步开发。