食品中金黄色葡萄球菌定量检测的不确定度评定

◎ 魏 敏，姜华军

（威海市食品药品检验检测研究院，山东 威海 264210）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是一种革兰氏阳性球菌，广泛分布于自然界中，人和动物是其主要携带者，通常寄生于人和动物的皮肤表面及鼻腔、咽喉等上呼吸道黏膜，也存在于空气、水、土壤等环境中[1]。金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病微生物，其在适当的条件下能产生肠毒素，是引起食物中毒的主要原因[2-3]。金黄色葡萄球菌感染是世界性卫生难题，在美国等西方国家，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的1/3，我国每年也有此类中毒事件发生[4]。

金黄色葡萄球菌污染的食品主要有乳制品、蛋制品及各类熟肉制品等[5]。《食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）中规定了乳制品、肉制品等8大类食品中金黄色葡萄球菌的限量要求[6]。目前，对金黄色葡萄球菌的定量检测主要采用国家标准中的平板计数法。本文建立金黄色葡萄球菌定量检测的不确定度评定方法，分析确定影响检测结果的关键因素，并在实验过程中进行针对性的控制，提高检测结果的科学性和准确性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金黄色葡萄球菌标准菌种（CICC 21600，中国工业微生物菌种保藏管理中心）；磷酸盐缓冲液、Baird-Parker琼脂、冻干血浆、脑心浸出液肉汤和血琼脂平板（北京路桥技术股份有限公司）。

1.2 仪器与设备

PRACTUM1102-1CN电子天平（德国Sartorius公司）；Bagmixer 400SW拍击式均质器（法国Interscience公司）；KB115培养箱（德国Binder公司）；AB2-4S1生物安全柜（新加坡ESCO公司）；GE60DF立式压力蒸汽灭菌器（厦门致微仪器有限公司）。

1.3 方法

依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10—2016）第二法金黄色葡萄球菌平板计数法进行检验，检验程序见图1[7]。称取25 g经检测为金黄色葡萄球菌阴性的乳粉样品，置于盛有225 mL磷酸盐缓冲液的均质袋中，加入20 μL麦氏浊度为0.5 MCF的金黄色葡萄球菌标准菌种菌悬液，用拍击式均质器拍打2 min，制成1∶10样品匀液。用1 mL无菌吸管吸取1∶10样品匀液1 mL，注入盛有9 mL磷酸盐稀释液的无菌试管中，振摇试管使其混合均匀，制成1∶100样品匀液。按上述操作步骤，制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释1次，换1次1 mL无菌吸管。选择2个适宜稀释度的样品匀液，每个稀释度分别吸取样品匀液0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接种至3块Baird-Parker平板，涂布均匀后于（36±1）℃培养24～48 h。选取同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20～200 CFU的平板，计数典型菌落数，并进行染色镜检、血浆凝固酶试验和溶血试验，报告结果。

图1 金黄色葡萄球菌平板计数法 检验程序图

2 结果与分析

2.1 建立数学模型

数学模型如下：

式中：T为样品中金黄色葡萄球菌菌落数，CFU·g-1；A为某一稀释度典型菌落的总数，CFU·g-1；B为某一稀释度鉴定为阳性的菌落数，CFU·g-1；C为某一稀释度用于鉴定试验的菌落数，CFU·g-1；d为稀释因子。

2.2 不确定度分量的主要来源

通过对实际检测过程和数学模型进行分析，不确定度的主要来源有5个方面。①样品称量过程引入的不确定度。②样品定容过程引入的不确定度。③逐级稀释过程引入的不确定度。④接种Baird-Parker平板时引入的不确定度。⑤重复检测引入的不确定度。

2.3 不确定度分量的评定

2.3.1 样品称量过程引入的不确定度评定

本实验用感量为0.01 g的电子天平称取25.00 g样品，重复称量10次，样品质量均为25.00 g，因此不考虑称量重复性引入的不确定度。样品称量引入的不确定度主要有2个来源，分别是天平校准和可读性（分辨力）引入的不确定度。①校准。根据天平的检定证书和《电子天平检定规程》（JJG 1036—2008）[8]，感量为0.01 g的电子天平在0～500 g最大允许误差为±0.05 g，区间半宽度为0.05 g，按矩形分布，天平校准引入的标准不确定度为②可读性。天平的分辨力为0.01 g，区间半宽度为0.005 g，按矩形分布，天平可读性引入的标准不确定度为因此，样品称量过程引入的相对标准不确定度为urel(称量)=

2.3.2 样品定容过程引入的不确定度评定

本实验用250 mL量筒量取225 mL无菌磷酸盐缓冲液加入到均质袋中，制备1∶10样品匀液，定容过程引入的不确定度包括量筒校准引入的不确定度、温度引入的不确定度。①校准。根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[9]，250 mL量出式量筒在20 ℃时的容量允差为±2.0 mL，按矩形分布，校准引入的标准不确定度为②温度。《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）规定的是量筒在20 ℃时的容量允差，实验室环境温度为（20±2）℃，偏差为±2 ℃，水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃，因此温度偏差产生的溶液体积变化为±（225×2×2.1×10-4）=±0.094 5 mL，按矩形分布，温度引入的标准不确定度为：

因此，样品定容过程引入的相对标准不确定度为：

2.3.3 逐级稀释过程引入的不确定度评定

（1）吸取样品匀液时1 mL吸量管引入的不确定度。本实验逐级稀释过程采用1 mL吸量管吸取1 mL样品匀液，其引入的不确定度包括校准和温度2个方面。①校准。《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）规定，20 ℃时1 mL流出式分度吸量管（A级）的容量允差为±0.008 mL，按矩形分布，校准引入的标准不确定度为②温度。实验室环境温度偏差产生的溶液体积变化为±（1×2×2.1×10-4）=±4.2×10-4mL，按矩形分布，温度引入的标准不确定度为因此，1 mL吸量管引入的相对标准不确定度为：

（2）吸取稀释液时10 mL吸量管引入的不确定度。本实验逐级稀释过程采用10 mL吸量管吸取9 mL磷酸盐稀释液，其引入的不确定度包括校准和温度2个方面。①校准。《常用玻璃量器检定规程》JJG 196—2006规定，20 ℃时10 mL流出式分度吸量管（A级）的容量允差为±0.05 mL，按矩形分布，校准引入的标准不确定度为②温度。实验室环境温度偏差产生的溶液体积变化为±（9×2×2.1×10-4）=±0.003 78 mL，按矩形分布，温度引入的标准不确定度为：

因此，10 mL吸量管引入的相对标准不确定度为：

（3）逐级稀释过程的合成标准不确定度。进行1次逐级稀释使用1次1 mL和10 mL吸量管，其引入的标准不确定度为由 于10倍 系列稀释方法相同，故整个稀释过程的标准不确定度为10倍系列稀释的次数。本实验最终采用的是1∶1 000稀释度的平板进行菌落计数，因此进行了2次10倍系列稀释，q=2，逐级稀释过程引入的标准不确定度为

（4）接种Baird-Parker平板时引入的不确定度评定。接种过程使用1 mL吸量管吸取1 mL样品匀液以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接种量分别加入3块Baird-Parker平板。其引入的不确定度包括校准和温度2个方面，计算方法同2.3.3中（1），则接种0.3 mL和0.4 mL样品匀液引入的相对标准不确定度分别为：

因此，接种Baird-Parker平板时引入的标准不确定度为

（5）重复检测引入的不确定度评定。在相同条件下对同一样品重复测10次，由于金黄色葡萄球菌检测结果的发散性比较大，直接按贝塞尔公式计算样本标准差不合理，因此本研究将检测结果转换为对数值后进行计算，检测结果见表1[10-12]。

表1 乳粉中金黄色葡萄球菌定量检测结果表

采用贝塞尔公式法计算重复检测引入的标准不确定度为：

2.4 计算合成标准不确定度

以上各不确定分量是相互独立的，计算合成标准不确定度为：

2.5 计算扩展不确定度

根据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[13]，取置信概率p=95%，自由度v=10-1=9，由t分布表可得包含因子k=2.26，故扩展不确定度为U=k×uc(T)=2.26×0.029 31=0.066 2。

2.6 结果报告

样品中金黄色葡萄球菌检测结果的对数值lgX=4.592 2±0.066 2，k=2.26。取反对数后得到金黄色葡萄球菌定量检测结果的取值为33 574～45 541 CFU·g-1，修约后为34 000～46 000 CFU·g-1。

3 结论与讨论

本研究按照GB 4789.10—2016平板计数法对人工染菌的乳粉样品进行金黄色葡萄球菌的定量检测，并对检测过程中的不确定度进行分析和评定，不确定度来源主要有样品称量、样品定容、逐级稀释、接种及重复检测引入的不确定度。由于本实验采用添加阳性菌株制备人工染菌样品，鉴定为阳性的菌落数与用于鉴定实验的菌落数的比值（即B/C）均为1，因此未考虑鉴定实验引入的不确定度。根据各不确定度分量的评定结果，接种Baird-Parker平板引入的不确定度贡献最大，其次是重复检测引入的不确定度。重复性检测引入的不确定度主要受操作人员、检测环境、培养温度、培养时间、菌落计数和样品均匀性等因素的影响，属于A类不确定度，可用统计分析的方法进行评定，本研究采用了贝塞尔公式法进行评定[14]。实验室可根据测量不确定度的评定结果，从人员、仪器设备、培养基和试剂、检验方法和环境条件等方面加强控制，最大限度降低不确定度，提高检测结果的准确性和可靠性。

通过对金黄色葡萄球菌检测不确定度的评定，分析和评价影响检测结果的关键因素，可为实验室风险管理和质量控制提供指导，有效提高实验室质量管理水平。当检测结果在标准限量值附近时，结合测量不确定度判定产品是否合格更科学和准确[15]。