铁死亡参与脊髓损伤调控的研究进展

杜开颜，祁晨旭，曹静钰，陈蒙，高静，刘承梅*

1.河南中医药大学护理学院，郑州 450000；

2.河南中医药大学第一附属医院康复中心，郑州 450000

细胞死亡（cell death）贯穿于生物体生长发育的各个阶段，与疾病的发生、发展密切相关，目前国际上公认的细胞死亡方式包括程序性死亡和非程序性死亡［1-2］。2012年，Dixony等［3］正式提出了铁死亡（ferroptosis）的概念，并指出铁死亡是一种铁依赖性的程序性死亡。铁死亡最主要的特点包括细胞形态和细胞成分的改变。其中，形态变化表现为线粒体变皱缩小、膜密度提高、线粒体嵴弱化或者消亡，而分子改变特点是细胞内部的铁过载和脂质活性氧的集中，最终因细胞内发生脂质过氧化反应导致细膜破裂，细胞崩解死亡［4-5］。脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种严重的中枢神经性损伤疾病，导致严重的感觉以及运动功能受损［6］。李文祥等［7］在国内第一次进行区域性脊髓损伤的流行病学研究，发现发病年龄从（45.1±14.2）岁上升至（51.6±15.2）岁。据美国的脊髓损伤流行病学信息可知，美国此类病人大概在282 000例，年发病率约为5.4/10万人，每年增加17 000例［8］。目前，我国脊髓损伤发病率亦呈日益增长趋势［9］。SCI的病理机制包括原发性损伤与继发性损伤2类，原发性损伤主要是急性外力直接作用于脊髓或脊柱错位使脊髓被压或横断，损伤可造成局部神经细胞死亡、血管损伤及血脑屏障被破坏；继发性损伤主要包括炎症反应、细胞死亡、氧化应激等，其中细胞死亡主要由细胞膜损伤时通透性增加、细胞破裂、缺血性损伤等造成［10-13］。因此，调控神经细胞的死亡成为治疗SCI的一条重要途径。同时，该疾病的治疗逐渐成为神经学科领域的重点和难点［14］。本文查阅了近年国内外有关铁死亡在SCI方面的相关研究文献，总结了铁死亡参与SCI细胞死亡的主要机制途径，以期为治疗脊髓损伤带来新的思路。

1 铁死亡的分子调控机制

1.1 铁离子代谢

铁是生物体必需的营养元素之一，体内许多过程都离不开铁的调节，如：细胞分裂增殖、氧气运输和DNA复制合成等。各种能够与铁特异性结合的分子蛋白会影响细胞内外游离铁的含量。首先，铁调节蛋白1（iron regulatory protein，IRP-1）和铁调节蛋白2（IRP-2）作为细胞内铁的传感器，可以根据细胞内铁含量的大小，在起始端就开始调控铁的代谢，细胞膜转铁蛋白受体1（transferrin receptor，TFR1）作为IRP-1和IRP-2的靶标，可以与细胞外转铁蛋白结合，将结合的Fe3+转运至细胞内；接下来，细胞内的Fe3+在铁还原酶STEAP3的作用下被还原为Fe2+，Fe2+在二价金属转运体1（divalent metal transporter 1，DMT1）的作用下进入细胞质中，而剩余的铁则被存储在铁蛋白中；最后，细胞内的Fe2+在铁转运蛋白（也称SLC11A3）的作用下可以再氧化为Fe3+并运输至细胞外，使细胞内铁浓度维持在正常水平，保持细胞内铁代谢处于平衡之中，否则铁过量就会产生细胞毒性［15-17］。另外，铁具有不稳定性，极容易被还原为Fe2+或被氧化成Fe3+，故在底物之间的电子转移方面铁经常参与其中［18］。当铁死亡发生时，细胞内积累的大量游离铁易与H2O2发生芬顿反应（fenton reaction），芬顿反应式为Fe2++H2O2=Fe3++OH－+·HO，其产生的羟基自由基既可以直接对DNA、蛋白质及膜脂质造成氧化损伤，亦可促使脂质过氧化反应的发生，造成ROS累积，细胞膜发生损伤裂解导致细胞死亡［2］。Zhuo等［19］在原花青素通过抑制铁死亡促进脊髓损伤恢复的研究中，发现脊髓损伤后铁含量和脂质过氧化显著增加，用原花青素（procyanidine，PACs）处理后可部分降低铁含量同时降低脂质过氧化水平，表明铁诱导的芬顿反应可能与SCI后铁含量和脂质过氧化共同变化有关，从而通过减少铁含量来促进脊髓损伤功能为恢复。Totsuka等［20］发现活性氧ROS（reactive oxygen species）会反馈性对调节铁代谢的相关基因产生影响，调控细胞内Fe2+浓度。有研究证明，在铁死亡期间，细胞内的铁离子水平会显著增加，铁超载被认为是铁死亡的重要指标之一［21］。综上所述，铁代谢与铁死亡之间有密切的联系，铁离子在铁死亡中扮演着至关重要的角色。

1.2 脂质过氧化联合氨基酸代谢机制

脂质代谢和铁代谢是影响铁死亡的主要代谢通路。在脂质过氧化的起始阶段，脂质双分子层的磷脂（polyunsaturated fatty acids-phospholipids，PUFA-PLs）多不饱和脂肪酰基中被除去一个双烯丙基氢原子，生成磷脂过氧化自由基（PLOO·），PLOO·从多不饱和脂肪酸（PUFA）中获取氢，形成磷脂氢过氧化物（phospholipid hydroper-oxide，PLOOH）。另外，在谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase4，GPX4）作用下亦可转化成相应的PLOH、PLOOH和脂类自由基，若未发生转化，磷脂过氧化自由基和烷氧基磷脂自由基（PLO·）将进一步与PUFA-PLs反应形成脂质过氧化物的分解产物，因此，PUFA-PL含量高的细胞膜特别容易受过氧化反应的影响［22-23］。接着，多不饱和脂肪酸在脂酰辅酶A合成酶长链家族成员4（long-chain acyl-coa synthetase 4，ACSL4）作用下发生活化，随之在溶血卵磷脂酰基转移酶3（lysophospatidylcholine acyltransferase，LPCAT3）影响下，活化之后的脂肪酸全部转移到胞膜内，发生酯化，参与带负电位的膜磷脂氧化阶段；该阶段会出现较多的脂质过氧化物与脂质ROS，从而加重氧化应激反应，引起内皮功能障碍并激活炎症反应，这种连锁反应可能会导致细胞膜完整性受损，最终使细胞膜破裂，而这种连锁反应是诱发铁死亡的关键［24］。

另外，谷胱甘肽（glutathione，GSH）和活性氧ROS也是重要的诱发因素，GSH是谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase4，GPX4）的还原剂，如果细胞内GSH耗尽将会导致GPX4失活，GPX4属于谷胱甘肽过氧化物酶家族，是唯一能够清除细胞膜上磷脂氧化自由基的酶，GPX4活性降低或表达下降导致脂质过氧化，从而诱发铁死亡［25-26］。因此，GPX4可以说是铁死亡的主要调控者。谷氨酸为GSH合成的所需原料，细胞对谷氨酸摄取的最重要方式是谷氨酸胱氨酸转运体SystemXc-［27］。ROS产生的氧化损伤最初是在谷氨酸引导的细胞死亡途径中被发现，其中诱导产生的细胞毒性由谷氨酸受体激活发生钙离子内流或竞争性遏制SystemXc-形成［28］。因此，GSH的降低就是ROS形成氧化损伤的因素之一。有研究表示，铁死亡诱导剂erastin的靶点是谷氨酸-半胱氨酸反转运系统Xc-［29］。Xc-T将胱氨酸从细胞外转运至细胞内，同时将谷氨酸转运到细胞外，铁死亡诱导剂erastin是重要的System Xc-抑制剂［30］。活性氧属于活性较高的氧化自由基，主要包含超氧阴离子（O2-）等，一般情况下ROS被当作信号分子、调节分子和转录调控分子发挥自身功能，其中在活性氧等自由基浓度高于临界标准时，身体内部平衡遭受损坏，自由基较高，导致细胞、细胞器和脂类、蛋白质和DNA等成分受损，如果不能及时修复，可能会造成细胞死亡［2，31］。在谷胱甘肽依靠的脂质过氧化物修复系统受到伤害时，致死的脂质活性氧积累随之出现，进而造成铁死亡［13］。氧化应激通常是指活性氧生成和抗氧化防御系统不平衡，即铁死亡与氧化应激两部分都存在GSH降低，从而造成有关抗氧化系统受到伤害，最终线粒体内ROS超载，形成细胞毒性影响。如张焱等［32］探讨去铁胺（deferoxamine，DFO）对脊髓损伤的修复作用发现，与假手术组相比，损伤后脊髓中Xc-T含量、GPX4表达量和GSH表达显著下降，而在使用DFO治疗后其表达量均显著升高，说明DFO通过抑制铁死亡氧化应激信号通路修复脊髓损伤。Ming等［33］研究发现锌可以逆转脊髓损伤后的行为和结构改变。锌可增加NRF2/HO-1的表达，从而增加了谷胱甘肽过氧化物酶4、过氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽的含量，降低了脂质过氧化物、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和活性氧的水平。另外，锌还可以拯救受损的线粒体，有效地降低脊髓损伤和炎症因子水平，使用NRF2抑制剂布鲁萨托尔可逆转锌的作用。综上可知，锌对脊髓损伤具有修复效果，属于全新的治疗方式。

2 铁死亡与脊髓损伤机制

2.1 脊髓损伤后的损伤机制

脊髓损伤后主要划分为原发性与继发性两类，前者为脊髓承受的无法逆转的外力伤害；后者为继发于脊髓原发性创伤之后的诸多生化变化，包含血脑屏障功能问题、出血、部分位置的缺血、炎症反应、Ca2+溢出、电解质失衡、细胞凋亡、氧化应激等［34-35］，继发性损伤会造成脊髓损伤周围完好组织发生自身破坏，进一步加深SCI程度，可见脊髓损伤修复的关键在于如何有效抑制继发性损伤对细胞造成的破坏［36］。此外，脊髓损伤后亦出现营养因子分泌降低、轴突细胞受损和胶质瘢痕形成等现象，营养因子特别是脑源性营养因子具有修复损伤神经细胞的功能，轴突细胞再生体现出调整神经突触发育、分化及兴奋性传递的作用，从而改善神经细胞损伤；SCI发生后星形胶质细胞随之被激活，可见抑制胶质瘢痕形成也可修复细胞损伤，从而在修复脊髓损伤方面发挥重要作用［37-38］。非程序性细胞死亡是物理与化学要素深刻影响的结果，且无法进行调控；但脊髓损伤中广泛存在细胞凋亡，因此，调控细胞的程序性死亡是后期修复脊髓功能的重点［39］。

2.2 脊髓损伤后铁死亡与铁离子代谢

脊髓损伤后局部出血增加，红细胞受损产生较多的游离铁［40］。铁代谢主要有3类蛋白，首先是铁转运蛋白，包括转铁蛋白（transferrin，Tf）、转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）、铁蛋白（ferritin，Ft）以及二价金属铁转运体；其次是铁代谢蛋白，通常是铜蓝蛋白（Cp），Cp把Fe2+氧化成Fe3+，在不同组织之间Fe3+和Tf融合，之后和细胞膜上TfR融合转入细胞内展现出自身的作用；最后是铁调节蛋白，通常是铁调节蛋白（IRP）与铁调素［41-42］。在酸性环境下，Fe3+和转铁蛋白（Tf）全部分开，游离的Fe3+被铁还原酶前列腺六次跨膜蛋白3（STEAP3）变成Fe2+，然后被二价金属转运蛋白1（DMT1）与ZIP8/14转运到细胞质中进而发挥作用［43］。转铁蛋白与转铁蛋白受体内部含量的提高造成细胞内铁增多，过多的铁和脂质氢过氧化物利用芬顿反应形成脂质自由基，导致铁死亡［44］。李文祥等［7］研究表明，Liproxstatin-1干预脊髓损伤后Tf、TfR的表达量显著下降，说明Liproxstatin-1通过降低铁的摄入量，能够不断弱化芬顿效果，减少ROS的积累，遏制脊髓损伤导致的铁死亡。史健涛等［45］研究发现脊髓损伤后的大鼠铁离子显著增高，表明脊髓损伤存在铁超载现象，另外在脊髓损伤后TfR和DMT1蛋白表达增加，但用去铁胺干预后，TfR和DMT1蛋白表达明显下降，同时铁超载减轻，铁死亡现象得到抑制。Ge等［46］研究发现铁死亡抑制剂-1（ferrostatin-1）能显著降低脊髓损伤后脊髓内的铁含量；另外，通过普鲁士蓝染色进一步验证了ferrostatin-1能显著减少脊髓损伤中的铁聚集。该实验从机理上讲，ferrostatin-1在一定程度上可消除铁累积导致的铁沉积相关基因和蛋白质上调和线粒体缩小现象，有利于脊髓损伤后功能的恢复。

2.3 脊髓损伤后铁死亡与脂质氧化应激机制

脊髓损伤后，周围组织细胞发生血管破裂导致出血水肿，诱导白细胞介素等促炎因子释放，产生炎症反应，导致ROS超载，从而引起铁死亡发生［47-49］。如Zhang等［50］通过上调脊髓损伤后大鼠的抗铁死亡因子GPX4、GSH和xCT以及下调脂质过氧化标志物4HNE，并用铁死亡抑制剂SRS 16-86治疗，发现治疗后炎性细胞因子IL-1β、TNF-α和ICAM-1明显降低，并且可减轻脊髓损伤后星形胶质细胞增多症，提高神经元存活率，为脊髓损伤的治疗提供了新靶点。Oliveira等［51］发现，通过对脊髓损伤4 h后的老鼠鞘内注射不同浓度的芋螺毒素MVIIA与假手术组相比，最佳剂量的MVIIA 10μm鞘内应用后可促进神经保护作用：神经元死亡率降低（22.46%），氧化应激减少，促凋亡因子（Bax、nNOS、Caspase-3、Caspase-8）表达减少，线粒体活性和抗凋亡因子（Bcl-xl）表达增加，提示MVIIA可通过抗氧化作用来保护神经。

2.4 脊髓损伤后铁死亡与氨基酸代谢机制

GPX4和胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白system Xc-（xCT）是铁死亡的主要调节因素，当GPX4活性降低，无法清除细胞膜上磷脂中氧化自由基的酶时，导致脂质过氧化和ROS积累，进而诱发铁死亡。脊髓损伤后，局部组织发生缺血缺氧，导致GPX4酶活性降低，xCT表达下调，进而导致细胞死亡［52］。有研究表明［53］，脊髓损伤后进行Western blot检测发现，铁死亡标志物GPX4、x-CT相比于对照组显著下降，而ACSL4、5-LOX表达升高且脂质过氧化标志物4HNE和铁离子浓度增加；使用依达拉奉治疗后大鼠脊髓组织内GPX4和x-CT的占比显著提高，ACSL4和5-LOX明显降低，抑制ROS的增加，说明依达拉奉可以避免大鼠脊髓损伤急性期出现的铁死亡。Zhou等［54］通过应用原花青素PACs处理脊髓损伤的小鼠，发现PACs可增加GSH、GPX4、Nrf2和HO-1的表达水平，改善脊髓损伤小鼠的运动功能，同时提示，PACs可抑制SCI中的铁死亡。

3 展望

越来越多的研究显示脊髓损伤与铁死亡密不可分。铁死亡主要有2个途径：铁代谢和脂质过氧化，大量研究基于这2种代谢途径来探索其中的各种信号通路，如Nrf2/HO-1信号轴、氧化酶（LOX）通路等。铁死亡的发生是在多种基因表达和不同信号通路的调控下所产生的一系列复杂的生化反应结果。铁死亡作为近年来新发现的细胞死亡方式，其相关的调控机制尚未研究清楚。脊髓损伤后，同样会发生一系列的氧化应激反应、微循环障碍等，微环境发生变化促进细胞死亡，其具体分子机制有待进一步研究。有研究证实，铁聚集与小胶质细胞激活息息相关［55］，而确定铁积聚和胶质细胞的激活对铁死亡造成的影响进而会反映在脊髓损伤相关机制的哪些方面还需要更深入研究。目前，临床上对于脊髓损伤的研究多从单一治疗方法入手，后续可以考虑联合多种治疗方法进一步探究。另外，中医药对脊髓损伤的治疗效果可观，但是从铁死亡的方向出发探究改善脊髓损伤作用机制仍需后续深入研究。另一方面，神经源性膀胱作为脊髓损伤最常见的并发症之一［56］，铁死亡在其发生机制中扮演了什么角色，是否通过抑制铁死亡来改善神经源性膀胱，这是未来需要进一步探究的问题。将脊髓损伤和铁死亡两者结合研究，这样有利于弄清楚临床上脊髓损伤后出现各种症状的原因，或许能为治疗该疾病提供新的治疗方法。