基于HS-SPME-GC-MS的小龙虾加工水煮液中挥发性风味成分萃取条件优化

杨祺福

徐文思1,2,3,4,5

胡思思1,2,3,4,5

马嘉晨1,2,3,4,5

黄 迪1,2,3,4,5

刘丽萍1,2,3,4,5

贺 江1,2,3,4,5

杨品红1,2,3,4,5

周顺祥6

(1. 湖南文理学院生命与环境科学学院，湖南 常德 415000；2. 水产高效健康生产湖南省协同创新中心，湖南 常德 415000；3. 环洞庭湖水产健康养殖及加工湖南省重点实验室，湖南 常德 415000；4. 水生动物重要疫病分子免疫技术湖南省重点实验室，湖南 常德 415000；5. 常德市农业生物大分子研究中心，湖南 常德 415000；6. 顺祥食品有限公司，湖南 益阳 413200)

小龙虾是一种淡水经济虾类，因滋味鲜美广受消费者喜爱。其水煮液是加工过程中的副产物，具有浓郁的小龙虾鲜香味及丰富的营养成分[1]，直接排放不仅造成资源浪费，还污染环境。食品风味是衡量食品食用品质的一个重要指标，风味成分种类、含量对食品最终风味的形成起着重要作用，而风味前体物质在加热后发生分解及氧化还原等一系列化学变化，是食品中挥发性风味物质产生的主要途径之一[2-3]。食品中风味物质常用的提取方法有顶空固相微萃取法(HS-SPME)、微波辅助萃取法(MAE)和同时蒸馏萃取法(SDE)等[4]。HS-SPME多数与气相色谱—质谱技术(GC-MS)联用形成一种快速高效的分析提取技术，具有前处理简单、分析时间短、重复性佳等优点，被广泛应用于食品及农产品检测分析等行业[5-6]。该技术检测效果受到多种因素影响，主要有萃取头类型、萃取温度、萃取时间、盐度和平衡时间等[7]。研究拟以小龙虾加工水煮液为研究对象，通过单因素结合正交试验优化HS-SPME-GC-MS技术检测小龙虾加工水煮液中挥发性风味物质的最佳萃取条件，并分析其挥发性风味物质组成，以期为小龙虾加工水煮液的回收利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

水煮液：参照文献[1]制备；

氯化钠(NaCl)：分析纯，湖南汇虹试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

气相色谱—质谱联用仪：7820A GC-5977E MSD型，美国Agilent Technologies公司；

顶空固相微萃取手动进样手柄：SAAB-57330U型，上海安谱实验科技股份有限公司；

固相微萃取头：SAAB-57328U型，50/30 μm DVB/CAR/PDMS，上海安谱实验科技股份有限公司；

电子天平：AUX120型，日本岛津公司；

恒温水浴锅：HH-2型，上海秋佐科学仪器有限公司；

磁力搅拌器：TALBOYS 7X7型，美国Henry Tormenter公司。

1.2 试验方法

1.2.1 固相微萃取头老化 选用50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头，250 ℃的GC进样口处老化20～30 min，直至GC-MS测定无干扰峰出现。

1.2.2 顶空固相微萃取 参照文献[8]。

1.2.3 GC-MS分析 参照文献[9]，并根据GC-MS分析结果中各成分相对保留时间，通过N1ST14.L质谱库进行检索定性，分析相似指数(SI)≥80%化合物的检索结果[10]。

1.2.4 单因素试验 以挥发性风味物质的峰个数和总峰面积作为指标，分别考察平衡时间(0，5，10，15，20 min)、NaCl添加量(0%，10%，20%，30%，40%)、萃取时间(20，30，40，50，60 min)和萃取温度(65，70，75，80，85 ℃)对小龙虾加工水煮液中挥发性风味物质萃取效果的影响。

1.2.5 正交试验 在单因素试验基础上，以综合评分为标准，设计L9(34)正交试验表优化HS-SPME-GC-MS萃取工艺。

1.2.6 综合评分 参照文献[10]，峰个数与总峰面积的权重系数为0.5，按式(1)计算综合评分。

(1)

式中：

A——综合评分；

Mi——挥发性风味物质峰个数；

Mmax——挥发性风味物质峰个数最大值；

Ni——挥发性风味物质总峰面积；

Nmax——挥发性风味物质总峰面积最大值。

1.3 数据处理

采用Design-Expert 8.0.6软件进行正交试验设计，所有数据均平行测定3次取平均值；采用SPSS 16.0软件对数据进行统计学分析，Tukey检验，P<0.05。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 平衡时间 由图1可知，当平衡时间≤20 min时，挥发性物质的峰面积无显著变化，但在15 min时达最大值；挥发性组分峰个数先略有增加后明显减少，5 min时峰个数最多。通过综合评分计算，当平衡时间为5 min时，挥发性风味物质达到相对平衡状态，有利于萃取头吸附。分子在空气中比在其他介质中扩散快，顶空萃取时很容易达到平衡状态，随着平衡时间的延长，萃取头趋于饱和，会影响其萃取吸附效果，甚至解吸附。故选择5 min 为最佳平衡时间。

2.1.2 NaCl添加量 由图2可知，随着NaCl添加量的增加，挥发性成分的峰面积先显著增大后显著减小，当NaCl添加量为20%时达最大值；挥发性组分的峰个数先下降后上升再显著减少，当NaCl添加量为20%时达最高值。适量的盐离子可增加待测组分的离子强度，提高HS-SPME分析法的灵敏度，但若NaCl添加过量，一些挥发性组分的扩散速度可能会因此降低，进而影响基质分子基团之间的相互作用[9]。故最佳NaCl添加量为20%。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图1 平衡时间对小龙虾水煮液中挥发性风味成分萃取效果的影响

字母不同表示差异显著(P<0.05)图2 NaCl添加量对小龙虾水煮液中挥发性风味成分萃取效果的影响

2.1.3 萃取时间 由图3可知，当萃取时间为20～60 min 时，挥发性成分的峰面积先明显增大后减小，在40 min时达最大值；挥发性组分的峰个数先显著增加后略有减少，在40 min时达最高值。当萃取时间为40 min时，挥发性物质到达平衡状态，萃取头处于饱和。若萃取时间过长，已经被吸附的组分可能出现解吸附现象，反而会降低萃取效果[11]。综上，40 min为最佳萃取时间。

2.1.4 萃取温度 由图4可知，当萃取温度为65～85 ℃时，随着萃取温度的升高，挥发性成分的峰面积先显著增大后无明显变化，在75 ℃时达最大值；挥发性组分的峰个数先明显增多后显著减少，在75 ℃时达最高值。当萃取温度为75 ℃时，一个相对高的温度下，能够加快挥发性组分的运动速率，促进挥发性成分被萃取头富集和吸附，水煮液中绝大部分挥发性物质挥发出来并被吸附，才能达到最佳的萃取效果。萃取温度过高，低沸点组分可能因与高沸点组分的竞争吸附处于劣势而损失，此外，高温还能使部分挥发性化合物发生变性或裂解[11]。综上，75 ℃是一个相对稳定的萃取温度。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图3 萃取时间对小龙虾水煮液中挥发性风味成分萃取效果的影响

字母不同表示差异显著(P<0.05)图4 萃取温度对小龙虾水煮液中挥发性风味成分萃取效果的影响

2.2 正交试验

结合单因素试验结果，选取平衡时间、NaCl添加量、萃取时间和萃取温度为试验因素，采用正交试验设计对小龙虾加工水煮液中挥发性风味物质萃取条件进行优化，试验因素水平表见表1，试验设计及结果见表2，方差显著性分析见表3。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal design factor level

表2 L9(34)正交试验结果Table 2 L9(34) orthogonal experimental design results

由表3可知，各因素对挥发性风味物质的综合评分影响大小为A(平衡时间)>D(萃取温度)>C(萃取时间)>B(NaCl添加量)。最佳萃取条件为A1B3C3D2，即平衡时间0 min、NaCl添加量30%、萃取时间50 min、萃取温度75 ℃，此时综合得分为95.47，与预测值相对误差为4.53%。采用方差分析和显著性检验(F检验)进一步分析[12]，各因素的F值均未超过临界值F0.05(4.46)，即在5%的置信区间内，各因素的交互作用无显著影响，F值检验灵敏度相对较低，可能是由误差自由度较小导致的。

表3 正交试验方差分析Table 3 Significant analysis of variance

2.3 小龙虾水煮液中挥发性风味物质分析

小龙虾水煮液中挥发性风味物质的总离子流图如图5 所示，挥发性风味物质成分及相对含量见表4。

图5 HS-SPME萃取小龙虾水煮液挥发性风味物质GC-MS总离子流图Figure 5 GC-MS total ion chromatogram of volatile flavor compounds extracted from crayfishboiled liquid by HS-SPME

2.3.1 醛类和芳香族化合物 由表4可知，小龙虾水煮液中共检出12种醛类化合物，其相对含量占总挥发性风味成分的33.78%，芳香族化合物5种，占37.34%。其中苯甲醛和己醛的相对含量最高，分别达13.47%，12.05%，呈杏仁香、坚果香、水果香以及油脂、青草味[15-16]，是小龙虾加工水煮液中重要的风味贡献物质。其他有风味贡献的醛类及芳香族化合物依次是苯乙醛(8.31%)、庚醛(6.39%)、壬醛(3.31%)、辛醛(1.69%)、癸醛(1.37%)、戊醛(0.71%)、反-2-壬烯醛(0.58%)、2-甲基2-辛烯醛(0.33%)和(E)-2-癸烯醛(0.24%)，基本呈油脂香和果香，是小龙虾水煮液中主要的风味成分。水煮液中检出的芳香族化合物的相对含量最高，近40%，主要呈清香、果香和木香，对丰富小龙虾水煮液的风味起重要作用。

表4 小龙虾水煮液中挥发性风味成分†Table 4 Volatile flavor components in crayfish boiled liquid

2.3.2 醇类和杂环化合物 水煮液中检出醇类化合物5种，占10.96%，其中5-甲基-2-(1-甲基乙基)-环己醇的相对含量最高(4.79%)，其次是2-乙基己醇(2.04%)，且呈脂香、玫瑰香味[15-16]。对小龙虾水煮液风味贡献的其他醇类成分较少，而烯、酮、酚类等杂环化合物有5种，占11.01%。其中，(E)-6,10-二甲基-5,9-十一烷二烯-2-酮也称丙酮香叶酯，具有清香、果香、木香[14]。醇类和杂环化合物对小龙虾水煮液的风味有一定的贡献作用。

2.3.3 烃类和酯类化合物 烃类物质一般无特殊香味，主要是由脂肪酸烷氧自由基均裂产生，一般会有所谓的烷烃气味[18]。水煮液中共检出烷烃类化合物5种，占3.34%。其中十二烷的相对含量最高(1.15%)，其次是十三烷(0.83%)。烃类物质是肉类风味组分中杂环化合物的重要中间体，但其对小龙虾水煮液风味的贡献作用较小。而酯类化合物主要由酸和醇之间发生的酯化反应生成[19]。小龙虾水煮液中仅检出2种酯类化合物，即邻苯二甲酸丁基环己酯和乙酸乙酯，其相对含量为3.57%。虽然酯类种类和含量较少，但一些杂环化合物也可以归为酯类，如丙酮香叶酯，其主要提供水果香、花香等气味[20]。在小龙虾水煮液整体风味成分中，酯类化合物能起到微妙的作用。

HS-SPME有利于提取易挥发性化合物，如短链脂肪酸或醇类[21]，且出峰快。小龙虾水煮液中挥发性风味物质共检出34种，包括醇类5种(10.96%)、醛类12种(33.78%)、烷烃类5种(3.34%)、芳香族化合物5种(37.34%)、杂环化合物5种(11.01%)、酯类2种(3.57%)。而同时蒸馏萃取法(SDE)容易提取挥发性和半挥发性风味成分，出峰相对较慢。采用SDE-GC-MS技术从小龙虾水煮液中共检出73种挥发性风味物质，包括烷烃类28种(47.77%)、酯类12种(43.40%)、醛类9种(8.94%)、芳香族6种(7.31%)、醇类5种(7.28%)、酸类4种(14.09%)[1]。因此，可以认为醛类、芳香族类和酯类为小龙虾水煮液中主要的挥发性风味物质。SDE法萃取时间较长，但能萃取到更多的挥发性化合物，适合对高沸点、低挥发性物质的分离；HS-SPME法出峰少，但快速简便、更接近真实挥发风味，适合检测易挥发性的化合物[22]。

3 结论

通过HS-SPME-GC-MS结合正交试验优化小龙虾加工副产物水煮液中挥发性风味物质的萃取条件。结果表明，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头老化后，不需要平衡，最优萃取工艺条件为NaCl添加量30%，萃取时间40 min、萃取温度75 ℃，此条件下小龙虾加工水煮液中挥发性风味物质共检出34种，其中醛类和芳香族化合物的相对含量较高，其次为醇类和杂环化合物，烷烃类和酯类化合物的相对含量较少。HS-SPME法萃取小龙虾加工水煮液中挥发性风味成分的方法简便快捷，但在相同检测方法下分析出的挥发性风味成分相对较少，后续可以结合SDE法萃取小龙虾加工水煮液中的挥发性风味物质。