富含叶酸血糯米西米保健酸奶的研制

张 杰，朱 玲，任文艳，游新侠，魏希颖

（1.郑州科技学院 食品科学与工程学院，河南 郑州 450064；2.郑州市食品安全快速检测重点实验室，河南 郑州 450064；3.陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安 710119）

血糯米，又称红糯米、红莲糯、鸭血糯，米皮紫红，米粒长，气香而味腴，是江苏常熟的特产之一[1]。其富含蛋白质、碳水化合物、维生素、微量元素和天然色素，具有护肝养颜、提高血红蛋白、预防贫血等保健功效[2]。西米，又称西谷米，产于马来群岛一带，是取棕榈科植木中的淀粉加工而成，具有健脾、化痰、补肺的功效[3]。叶酸又称维生素B9，是机体细胞生长和繁殖必不可少的维生素之一，主要功能是参与遗传物质合成和蛋白质的代谢，具有促进动物的生长、提高机体免疫力、影响机体繁殖等功能[4-5]。缺乏叶酸，会引起婴儿神经管畸形、儿童贫血和发育迟缓等疾病，因此世界卫生组织推荐叶酸使用量为：成人200 μg/d，孕妇和乳母400 μg/d[6]。

酸奶是以鲜牛奶、鲜羊奶或者奶粉为原料，通过杀菌冷却后添加乳酸菌发酵剂，恒温发酵而制得的一种发酵奶制品[7]。酸奶发酵前后添加不同谷物制得的谷物酸奶，赋予酸奶独特的谷物风味，提高了酸奶的营养价值，同时具有优化肠道菌群、提高免疫力和抗氧化活性等功能，是近些年的研究热点之一[8-10]。杨露西等[11]以杂粮藜麦和奶粉为主要原料，通过浸泡、蒸煮、磨浆、过滤、发酵等工序，制作了一款藜麦酸奶，采用单因素试验和正交试验对其工艺进行优化，确定的最佳工艺条件是发酵时间7 h、白砂糖添加量8%、菌种接种量为0.3%、发酵温度40 ℃、藜麦浆添加量20%，此时的藜麦酸奶偏微黄色、细腻丝滑、谷物味浓郁。对其进行挥发性成分分析，结果表明藜麦酸奶中挥发性成分多达35种，主要是酯类、酸类、酮类和醛类物质。王芬等[12]以紫米、新鲜牛奶和蔗糖为主要原辅料，以酸度、持水力和感官评价为评价标准，通过单因素试验和响应面试验对加工工艺进行优化，研制了一款紫米酸奶，并对其贮藏品质和抗氧化能力进行测定。研究表明，其最佳加工工艺为熟紫米粉添加量22 g/L、蔗糖添加量7%、发酵剂接种量0.06%，与对照组相比，紫米酸奶具有更长的储存期和更强的抗氧化能力。张小芳等[13]以红豆和全脂奶粉为主要原材料，以酸度、活菌数和感官评分为评价指标，通过单因素试验和响应面试验对其配方进行优化，制作了一款红豆酸奶。结果表明，当红豆与水的料水比1∶4（g∶mL）、红豆浆添加量44%、蔗糖添加量7%时感官评分最高，此时的红豆酸奶呈淡红色，酸甜适宜，具有红豆和酸奶的独特风味。

血糯米和西米具有不同的营养成分和营养结构，且与酸奶之间没有拮抗效应，将其与纯牛奶搭配用于制作谷物酸奶，能够显著提高酸奶的营养价值。本试验以血糯米、西米和纯牛奶为主要原料，添加叶酸进行营养强化，制作一款适合孕妇食用的血糯米西米保健酸奶，填补了市场的空白，丰富了谷物酸奶的种类。同时探讨了叶酸在酸奶发酵和冷藏贮存条件下的损失率，为功能性酸奶的开发提供了一定的理论支持，也为孕妇和乳母补充叶酸提供了新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

血糯米：安徽回音谷农产品有限公司；西米：广州颗颗珍珠食品有限公司；纯牛奶（蛋白质3.2 g/100 mL，脂肪4.0 g/100 mL，碳水化合物4.8 g/100 mL）：蒙牛乳业有限公司；蔗糖：南京甘汁园糖业有限公司；嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）：山东创益生物科技有限公司；叶酸（食品级）：浙江恒发食品科技有限公司；体积分数为95%乙醇：瑞康医用科技有限公司；浓盐酸：山东旭晨化工科技有限公司；氢氧化钠：上海琳帝化工有限公司；酚酞：国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸：天津市大茂化学试剂厂；无水硫酸铜：东莞市勋业化学试剂有限公司；硫酸钾：西陇科学股份有限公司；琼脂粉（生化试剂）：北京奥博星生物技术有限公司。试验所用化学试剂均为分析纯。

MC培养基、MRS培养基：北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

HH·BII·420-BS型电热恒温培养箱：上海跃进医疗机械厂；KDN-08B（04B）型定氮仪：上海洪纪仪器设备有限公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；NDJ-1型黏度计：上海佑科仪器仪表有限公司；SCIENT-60型均质机：宁波新芝科技股份有限公司；UV-2800H型紫外可见分光光度计：上海菁华仪器有限公司；SWCJ-2G型双人超净工作台：浙江孚夏医疗科技有限公司；800A型粉碎机：永康市红太阳机电有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血糯米西米保健酸奶加工工艺流程[14]

1.3.2 操作要点

血糯米、西米预处理：挑选粒大饱满、无虫害、无霉变的血糯米和西米，血糯米清洗3～5遍，西米清洗1遍，置于60 ℃烘箱中热烘2 h。

炒制：将烘干的血糯米和西米分别置于炒锅中进行炒制，炒熟即可[12]。

粉碎：用小型粉碎机将血糯米、西米分别进行粉碎。

过筛：粉碎后的血糯米粉和西米粉过100目筛，备用。

混匀：称取血糯米、西米粉7 g（血糯米粉与西米粉质量比为1∶1），称取蔗糖3.5 g，加入50 mL纯牛奶中，混合均匀。

加热溶解：将混合液进行加热，加热时要不停搅拌防止糊锅，直到混合米粉和蔗糖完全溶解。

均质：将牛奶混合液置于均质机中，15 MPa的压力、65 ℃的温度条件下均质120 s。

灭菌：均质后混合液85 ℃下灭菌30 min，冷却45 ℃后备用[15]。

发酵：将灭菌的样品装入无菌布丁杯中，加入0.2%乳酸菌发酵剂（嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌比例1∶1）[16]和500 μg/100 g叶酸，混匀后放入恒温发酵箱中，42 ℃条件下发酵7 h至完全凝乳为止。

冷藏后熟：发酵好的酸奶置于4 ℃冰箱中冷藏7 h[17]，即得血糯米西米保健酸奶。

1.3.3 血糯米西米保健酸奶工艺条件优化

（1）单因素试验设计

以纯牛奶为基准，血糯米与西米质量比分别为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，血糯米与西米添加量分别为6%、10%、14%、18%、22%，蔗糖添加量分别为5%、6%、7%、8%、9%，发酵剂添加量（嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌比例1∶1）分别为0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%，均质时间分别为60 s、120 s、180 s、240 s、300 s，发酵时间分别为4 h、5 h、6 h、7 h、8 h，分别进行单因素试验，探究原料比例及添加量、蔗糖添加量、发酵剂添加量、均质时间和发酵时间对血糯米西米保健酸奶的酸度、黏度、感官评价的影响。

（2）响应面法试验设计

根据单因素试验的结果，固定血糯米与西米质量比为1∶1，均质时间为120 s，选择对结果影响较大的血糯米与西米添加量（A）、蔗糖添加量（B）、发酵剂接种量（C）和发酵时间（D）4个因素为自变量，以感官评分（Y）为响应值，进行4因素3水平Box-Behnken响应面优化试验。响应面优化试验设计因素与水平见表1。

表1 血糯米西米保健酸奶工艺条件优化Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for process conditions optimization of red glutinous rice and sago health yogurt

1.3.4 血糯米西米保健酸奶的感官评分标准

根据GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》[18]和相关文献[19-20]，制定感官评分表，评分表见表2。组织10位食品科学与工程学院的学生分别从色泽（20分）、滋味（25分）、气味（25分）、组织状态（30分）四个方面进行打分，满分为100分，总分取平均值。

表2 血糯米西米保健酸奶感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards of red glutinous rice and sago health yoghurt

1.3.5 叶酸营养强化血糯米西米保健酸奶试验

以血糯米西米保健酸奶的最佳加工工艺为基础，在加入发酵剂的同时，采用直投式添加叶酸，添加量为500μg/100g，制得富含叶酸血糯米西米保健酸奶，并探讨叶酸在酸奶发酵、后熟及冷藏过程中的变化规律。

1.3.6 产品理化及微生物指标测定

叶酸含量测定：按照GB 5009.211—2014《食品中叶酸的测定》中的微生物法[21]；黏度：采用旋转式黏度计测定，根据酸奶的特性选择3号转子，转速为6 r/min，测定时将样品刚好没过转子刻度线，待转子稳定后记录数据[22-23]；蛋白质、酸度、乳酸菌总数、致病菌、酵母菌和霉菌：根据GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》[18]中规定的检测方法进行检测。

2 结果与分析

2.1 血糯米西米保健酸奶工艺条件优化单因素试验结果

2.1.1 血糯米与西米质量比对血糯米西米保健酸奶品质的影响

由表3可知，血糯米与西米质量比对酸奶的酸度和黏度影响不显著（P＞0.05），随着质量比在3∶1～1∶3之间变化时，酸奶的酸度和黏度变化不大。对感官评分影响显著（P＜0.05），当质量比在3∶1～1∶1时，酸奶的颜色偏深，血糯米气味过重，掩盖了部分奶香味；当质量比在1∶1时，酸奶呈乳白色略带浅红色，组织细腻，口感较好，感官评分最高，为82.7分；当质量比＞1∶1之后，酸奶颜色偏浅，组织较为粗糙，口感较差。综合考虑，血糯米与西米最佳添加质量比为1∶1。

表3 血糯米与西米质量比对血糯米西米保健酸奶品质的影响Table 3 Effect of mass ratio of red glutinous rice and sago on the quality of red glutinous rice and sago health yogurt

2.1.2 血糯米与西米添加量对血糯米西米保健酸奶品质的影响

由表4可知，血糯米与西米添加量对酸奶的酸度、黏度和感官评分影响均显著（P＜0.05）。随着添加量的增大，酸奶的酸度与黏度逐渐增大，这是因为血糯米和西米中的低聚糖参与乳酸发酵，增大了酸奶的酸度[12]；血糯米和西米中的淀粉具有吸水性，能够增大酸奶的黏度[24]。当血糯米与西米添加量在6%～14%时，酸奶的酸度和黏度较低，颜色偏浅，血糯米与西米的风味不足；当血糯米与西米添加量在14%时，酸奶的酸度和黏度适宜，分别为78.6 °T和4.93 Pa·s，血糯米西米酸奶品质达到最好，感官评分最高，为84.6分；当血糯米与西米添加量＞14%之后，酸奶仍黏度较好，但酸度较高，血糯米与西米开始出现下沉现象，酸奶颜色偏深且不均匀，组织变得粗糙，感官评分有所降低。综合考虑，血糯米与西米最佳添加量为14%。

表4 血糯米与西米添加量对血糯米西米保健酸奶品质的影响Table 4 Effect of red glutinous rice and sago addition on the quality of red glutinous rice and sago health yogurt

2.1.3 蔗糖添加量对血糯米西米保健酸奶品质的影响

由表5可知，蔗糖添加量对酸奶的酸度、黏度和感官评分影响均显著（P＜0.05）。当蔗糖添加量在5%～7%时，少量的蔗糖能够促进乳酸菌的发酵，酸度和黏度呈上升趋势，但酸奶总体的甜度不够，感官评分较低；当蔗糖添加量在7%时，乳酸菌代谢最为旺盛，酸度及黏度达到最高，分别为76.9°T和4.98 Pa·s，此时酸奶酸甜可口，感官评分最高，为85.9分；当蔗糖添加量＞7%之后，过量的蔗糖提高酸奶里的渗透压，抑制部分乳酸菌的活性[25]，酸度和黏度略有下降，酸奶整体偏甜，感官评分有所下降。综合考虑，蔗糖最佳添加量为7%。

表5 蔗糖添加量对血糯米西米保健酸奶品质的影响Table 5 Effect of sucrose addition on the quality of red glutinous rice and sago health yogurt

2.1.4 发酵剂接种量对血糯米西米保健酸奶品质的影响

由表6可知，发酵剂添加量对酸奶的酸度、黏度和感官评分影响均显著（P＜0.05）。当发酵剂接种量在0.1%～0.2%之间时，酸奶的酸度及黏度较低，不能呈现出良好的凝固状态，酸奶风味不够明显；当发酵剂接种量在0.2%时，酸奶的酸度适宜，黏度达到最大，分别为76.9°T和5.01 Pa·s，其凝固状态较好，组织细腻，无乳清析出，酸甜适中，感官评分达到最高，为81.6分；当发酵剂接种量＞0.2%之后，大量乳酸菌迅速发酵，酸度持续升高，导致口感偏酸，同时凝乳过度，伴有乳清析出。综合考虑，最佳菌种添加量为0.2%。

表6 发酵剂接种量对血糯米西米保健酸奶品质的影响Table 6 Effect of starter inoculum on the quality of red glutinous rice and sago health yoghurt

2.1.5 均质时间对血糯米西米保健酸奶品质的影响

由表7可知，均质时间对酸奶的酸度影响不显著（P＞0.05），随着均质时间的增加，酸奶的酸度变化不大。对酸奶黏度和感官评分影响显著（P＜0.05），当均质时间在60～120 s时，酸奶黏度较高，血糯米与西米在酸奶中分布不均匀，导致酸奶颜色不均匀，口感粗糙，有颗粒感；当均质时间在120 s，酸奶黏度适宜，为5.06 Pa·s，其颜色均匀，呈乳白色略带浅红色，口感细腻顺滑，感官评分达到最高，为83.2分；当均质时间在120～300 s时，随着均质时间的继续增加，对酸奶的黏度及感官评分影响不大。因此，最佳均质时间为120 s。

表7 均质时间对血糯米西米保健酸奶品质的影响Table 7 Effect of homogenization time on the quality of red glutinous rice and sago health yogurt

2.1.6 发酵时间对血糯米西米保健酸奶品质的影响

由表8可知，发酵时间对酸奶的酸度、黏度和感官评分影响均显著（P＜0.05）。当发酵时间在4～7 h之间时，发酵时间较短，乳酸发酵不完全，产酸量不够，酸度较低，黏度较低，酸奶凝固状态不好，因此感官评分较低；当发酵时间在7 h时，乳酸发酵基本完成，酸奶凝固较好，组织细腻，酸甜可口，无乳清析出，此时酸度为79.8°T，黏度为5.02 Pa·s，感官评分最高，为81.2分；当发酵时间＞7 h之后，酸度继续上升，黏度略有下降，酸奶整体偏酸，伴有少量乳清析出，感官评分有所下降。综合考虑，最佳发酵时间为7 h。

表8 发酵时间对血糯米西米保健酸奶品质的影响Table 8 Effect of fermentation time on the quality of red glutinous rice and sago health yogurt

2.2 工艺条件优化响应面试验结果与分析

2.2.1 血糯米西米保健酸奶响应面法试验结果

根据单因素试验结果，固定血糯米与西米质量比为1∶1、均质时间120 s，选择对血糯米西米共发酵酸奶品质有较大影响的血糯米与西米添加量（A）、蔗糖添加量（B）、发酵剂接种量（C）、发酵时间（D）4个因素为自变量，以血糯米西米共发酵酸奶的感官评分（Y）为响应值，设计了4因素3水平响应面分析试验，试验方案及结果见表9，方差分析结果见表10。

表9 血糯米西米保健酸奶工艺条件优化Box-Behnken试验结果Table 9 Results of Box-Behnken experiments for process conditions optimization of red glutinous rice and sago health yogurt

表10 回归模型方差分析Table 10 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.0.6软件对结果进行回归拟合与方差分析，拟合得到回归方程为：Y=87.50+1.06A+2.68B+1.78C+1.10D+1.00AB-0.57AC-1.40AD-2.23BC+2.05BD-2.15CD-3.48A2-4.50B2-6.54C2-6.79D2

由表10可知，该模型P值＜0.000 1极显著，失拟项P值=0.051 9＞0.05不显著，表明方程拟合良好。回归方程的决定系数为R2=0.959 0，调整决定系数R2adj=0.918 1，可知此模型中的91.81%血糯米西米共发酵酸奶的感官评分变化来自于自变量A、B、C、D。由P值可知，一次项B、C，二次项A2、B2、C2、D2对感官评分的影响极显著（P＜0.01），一次项A、D，交互项BC、BD、CD对感官评分的影响显著（P＜0.05），交互项中AB、AC、AD对感官评分的影响不显著（P＞0.05）。由F值和显著水平可知，主要因素A、B、C、D对血糯米西米保健酸奶的感官影响顺序为：蔗糖添加量（B）＞乳酸菌接种量（C）＞发酵时间（D）＞原料添加量（A）。

2.2.2 各因素间交互作用分析

各因素交互影响的响应面与等高线见图1。由图1可知，当血糯米与西米添加量（A）、蔗糖添加量（B）、发酵剂添加量（C）和发酵时间（D）两两交互作用时，对血糯米西米共发酵酸奶感官评价均有影响，各响应面图坡面陡峭程度存在差异，等高线椭圆度各不相同，其中BC、BD、CD坡面较为陡峭，表明B、C、D之间具有良好的交互作用。各个坡面均呈现先上升后下降的变化趋势，能够说明存在感官评分的最大值点。

图1 各因素交互作用对血糯米西米保健酸奶感官评分影响的响应面及等高线Fig.1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on sensory score of red glutinous rice and sago health yogurt

利用Design-Expert 8.0.6预测血糯米西米保健酸奶最佳工艺条件为：血糯米与西米添加量为14.56%，蔗糖添加量7.33%，发酵剂接种量为0.20%，发酵时间为7.10 h，此时感官评分理论值为88.134 6分。为了便于实际操作，将工艺条件修正为：血糯米与西米添加量为15%，蔗糖添加量7%，发酵剂接种量为0.2%，发酵时间为7 h，按此条件进行3次重复验证试验，结果取平均值，得到感官评分实际值为89.6分，与预测值符合率达到98.4%，表明该回归方程可行。

2.3 叶酸在酸奶发酵及冷藏中的变化规律

由图2可知，酸奶发酵及冷藏过程中叶酸含量有所下降，其中发酵过程中叶酸含量由500 μg/100 g下降至432.3 μg/100 g，损失率为13.5%，这可能是因为发酵过程中的较高温度和保加利亚乳杆菌的吸收作用导致了叶酸的损耗[26]；后熟过程中叶酸含量由432.3 μg/100 g下降至424.7 μg/100 g，损失率为1.5%；4 ℃冷藏至5 d时，叶酸下降至401.6 μg/100 g，冷藏过程中损失率为4.6%，总损失率为19.6%。此条件下制作的血糯米西米共发酵保健酸奶能够实现叶酸的营养强化，每日食用100 g即可满足孕妇和乳母对叶酸的需求，无需进行额外药物补充。

图2 叶酸在血糯米西米共发酵酸奶发酵及冷藏过程中的变化规律Fig.2 Changes of folic acid in red glutinous rice and sago cofermented yogurt during fermentation and refrigeration

2.4 产品理化及微生物指标检测结果

表11 产品理化及微生物指标检测结果Table 11 Determination results of physiochemical and microbiological indexes of the product

3 结论

本试验是以纯牛奶、血糯米和西米为主要原料，以酸度、黏度和感官评价为评价指标，通过单因素和响应面试验优化其加工工艺，通过添加叶酸进行营养强化，研制出一款具有较高营养价值的血糯米西米共发酵保健酸奶。结果表明，最佳加工工艺为血糯米与西米质量比1∶1、血糯米与西米添加量为15%、蔗糖添加量7%、发酵剂接种量为0.2%、均质时间120 s、发酵时间为7 h，此时感官评分最高为89.6分。同时探究了叶酸在酸奶发酵及冷藏过程中的变化规律，结果表明叶酸在酸奶发酵、后熟和冷藏过程中均有损失，发酵、后熟及冷藏过程中损失率分别为13.5%、1.5%、4.6%，总损失率为19.6%。理化及微生物检测表明，酸奶黏度为5.78 Pa·s，酸度为78.5°T，蛋白质含量2.85 g/100 g，脂肪含量2.7 g/100 g，叶酸含量424.7 μg/100 g，乳酸菌总数为4.2×107CFU/g。

血糯米西米共发酵保健酸奶呈乳白色略带浅红色，凝乳均匀无杂质，质地细腻润滑，酸奶味香浓，酸甜可口，同时兼具特有的谷物风味。酸奶中叶酸具有预防疾病、促进胎儿发育等保健功能，可满足孕妇和乳母对叶酸的每日需求，为以后更多叶酸保健食品的开发提供了数据支持，也为功能性酸奶的开发提供一定的理论基础。