中药分析实验藿香正气水中乙醇含量测定探讨*

舒乐新，刘 雪，黄皓宇，魏金霞，许妍妍，李遇伯

(天津中医药大学中药学院，天津 301617)

中药分析学是我校中药学和中药制药专业大四学生的一门专业必修课，其中理论课54学时，实验课36学时，可见这是一门实用性很强的学科，所以实验内容的设置尤其重要。中药分析内容主要涉及杂质检查、鉴别和含量测定三大块，藿香正气水中乙醇的含量测定实验包含溶剂的限量检查和含量测定。

藿香正气水是日常生活中比较常见的中成药方剂，它的功效是解表化湿，理气和中。临床主要用于外感风寒、内伤湿滞或夏伤暑湿所致的感冒等[1]。由于它属于町剂，制备过程中有广藿香油、紫苏叶油这些挥发性成分存在，因此需要使用适当浓度的药用乙醇溶液，来提高有效成分的提取效率。但乙醇含量过高会产生毒副作用，而过低助溶挥发性成分含量会减少，因此需要严格控制乙醇浓度。《中国药典》规定对该类制剂需做乙醇量检查。2020版规定藿香正气水中乙醇含量应在40%～50%，主要采用气相色谱法测定各种含乙醇制剂中在20 ℃时乙醇含量[2]。

气相色谱条件的选择对乙醇含量结果的影响具有关键性作用，本实验主要对不同分流比选择和不同柱温选择对色谱条件进行考察，以探究色谱图的变化，摸索得到最佳实验条件以达到快速、准确测定乙醇含量的目的。此实验主要作为中药分析学实验的教学改革项目，目的是让学生了解此方面的知识，提高动手能力。能够独立完成藿香正气水的乙醇含量测定实验，掌握气相色谱法的原理和组成，适用范围等。毛细色谱柱法的流程，内标法定量的操作流程，为将来从事药物分析行业打下良好的基础。

1 仪器与试剂

气相色谱仪配备有氢焰离子检测器(Agilent 7820A型)，美国安捷伦公司制造；实验用水为娃哈哈饮用纯净水，天津娃哈哈食品有限公司制造；藿香正气水(批号为060034，060038，060040)，天津中新药业集团股份有限公司隆顺榕制药厂制造；乙醇、正丙醇均使用色谱纯，天津康科德科技有限公司制造。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：HP-5毛细色谱柱(30 m×320 μm×0.25 μm)，进样方式：手动进样。进样口温度：190 ℃。检测器温度：250 ℃。柱温：初始温度为40 ℃，保持4 min，再以25 ℃/min的速度升温至200 ℃并保持5 min。载气：氮气，载气流速：25 mL/min，氢气流速：30 mL/min，空气流速：300 mL/min，柱流速：1 mL/min。分流比为20:1，进样量：0.6 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密量取无水乙醇1 mL，内标物正丙醇1 mL置于100 mL容量瓶中，加超纯水稀释，定容至刻度线为止，摇匀，经过微孔滤膜过滤，所得续滤液即为对照品溶液，置于冰箱中密封保存。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取藿香正气水溶液1 mL，正丙醇1 mL置于100 mL容量瓶中，加超纯水稀释，定容至刻度线为止，摇匀，经过微孔滤膜过滤，所得续滤液即为供试品溶液，置于冰箱中密封保存。

2.4 色谱条件考察

2.4.1 分流比选择

在确定分流比时保持其他色谱条件一致为HP-5毛细色谱柱(30 m×320 μm×0.25 μm)进样方式：手动进样，进样口温度：190 ℃，检测器温度：250 ℃。载气：氮气，载气流速：25 mL/min，氢气流速：30 mL/min，空气流速：300 mL/min，柱流速：1 mL/min。升温程序：初始温度为40 ℃，保持4 min，再以25 ℃/min的速度升温至200 ℃并保持5 min。进样量：0.6 μL，仅改变分流比在10:1至50:1进行了多组试验。

表1 分流比的影响Table 1 Effect of the Split Ratio

随分流比增大，保留时间增大，峰面积减小，分离度增大，结果需考虑适宜的分离度与峰面积，最终选择了分流比20:1作为色谱条件。

2.4.2 柱温的选择

表2 初始柱温影响Table 2 Effect of the initial column temperature

对于乙醇的分离来讲，初始柱温是一大重要因素，本文以“2.2”下对照品溶液作为样品，分别以40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃等温度作为初始温度，其他的色谱条件均保持一致。

由表2可知柱温升高，出峰前移，保留时间缩短，分离度降低，峰面积与对称因子未见明显变化规律。考虑选择分离度高，保留时间适宜的条件，最终选择40 ℃为初始柱温。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性试验

图1 内标物正丙醇色谱图Fig.1 Chromatogram of n-propanol as internal standard

图2 乙醇和正丙醇混和标准品色谱图Fig.2 Chromatogram of mixed standard of ethanol and n-propanol

图3 乙醇和正丙醇混合样品色谱图Fig.3 Chromatogram of a mixed sample of ethanol and n-propanol

分别取1%(vol)正丙醇溶液、“2.2”所述对照品溶液和“2.3”所述供试品溶液，根据“2.1”项下的色谱条件进行测定，对色谱峰保留时间对比，正丙醇保留时间为3.35 min，通过比较色谱图可确定供试品溶液的乙醇峰位置，其保留时间为2.91 min，该峰峰形良好，且供试品中的其他微量成分并不干扰乙醇峰的出峰及测定，因此本试验方法适用于藿香正气水中乙醇含量的测定。

2.5.2 检测限与定量限

本试验按照“2.2”下1.0%(vol)对照品溶液为初始浓度，不断稀释。精密量取母液1.0 mL，加入5 mL带盖离心管中，再精密量取1.0 mL超纯水加入其中，盖盖子，摇匀，即得低浓度溶液。依照此法对溶液不断稀释，测量其信噪比。对溶液不断稀释，测量其信噪比，得到定量限为0.001%(vol)，检测限为0.0007%(vol)。

2.5.3 线性关系考察

精密量取无水乙醇5 mL加入100 mL容量瓶中，加超纯水定容，配置成5%(vol)的储备液，置于冰箱冷藏待用。精密量取5%(vol)储蓄液1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、20.0、30.0 mL分别置于100 mL容量瓶中，加入正丙醇1 mL，加入超纯水定容，分别配制成浓度为0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.0%、1.5%(vol)的对照品溶液，置于冰箱冷藏待用。精密吸取乙醇不同浓度系列对照品溶液各0.6 μL，以“2.1色谱条件”进行进样，测定。用所得数据进行线性回归，纵坐标Y为乙醇峰面积与内标物峰面积的比值，横坐标X为乙醇浓度。结果得回归方程为Y=0.806X+0.0046，相关系数R=0.9997。依数据可见，在0.05%～1.5%(vol)浓度范围之间，线性关系良好。

2.5.4 精密度试验

取“2. 2”项下对照品溶液，依照“2. 1”下色谱条件重复进样6次，记录乙醇峰与正丙醇峰峰面积，计算两者比值，计算平均值与RSD。结果得乙醇峰峰面积与正丙醇峰峰面积比值的RSD为1.7%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.5.5 回收率试验

取生产批号为060034的藿香正气水三份，由所得数据可知其乙醇含量为46.0%(vol)，将三份样品各1.0 mL分别置于100 mL容量瓶中，分别加入无水乙醇，加入量为溶液乙醇含量的80%、100%、120%，加入正丙醇1.0 mL，再加入超纯水溶解，稀释至刻度线，摇匀，按照“2.1”项下色谱条件进样，计算乙醇总含量，减去样品中原有含量，算出加样回收率。加样回收率分别为97.11%，101.85%，98.03%，RSD分别为0.6%，1.1%，1.2%(n=3)。

2.5.6 重复性试验

取同一批号的藿香正气水样品，生产批次为060034，按照“2.3”项下配置方法制备6份供试品，分别进样测定，记录乙醇峰与正丙醇峰峰面积，计算两者比值，计算平均值与RSD。RSD为1.7%(n=6)，本试验方法重复性良好。

2.5.7 稳定性试验

取同一批号的藿香正气水样品，生产批次为060034，按照“2.3”项下配置方法制备供试品溶液，而后，分别于0，1，2，4，6 h进样，记录乙醇峰与正丙醇峰峰面积，计算两者比值，计算平均值与RSD。RSD为1.6%，表明该供试品溶液在6 h内稳定。

2.5.8 样品测定

取生产批号分别为060034，060038，060040的3批藿香正气水药品，按照“2.3”项下制备方法分别配制三份供试品溶液，每份供试品溶液进样三次，记录两峰峰面积，按照内标法内容以峰面积计算出供试品乙醇含量。

结果见表3，三批药品的乙醇含量分别为46.0%、45.0%、48.0%。中国药典2020版中规定，藿香正气水中的乙醇含量应在40%～50%之间，综上所述，这三批药品符合国家药典标准。

表3 不同批次样品的乙醇含量测定Table 3 Determination of ethanol content of different batches of samples

3 结 论

本文采用气相色谱法对藿香正气水的乙醇进行含量测定，建立并优化了含量测定方法。气相色谱条件对乙醇含量结果的影响因素主要有色谱柱的选择、定量方法、内标物的选择、进样方式等[3-8]。由于本实验使用手动进样，与自动进样方式相比较，手动进样时进样量会存在差异，从而导致重复性差，RSD值偏高，为了降低进样量带来的误差，本实验使用了内标法。在稀释醇类物质时，常常选用超纯水或甲醇作稀释剂[9-10]，但由于甲醇是一种有毒的挥发性成分，因此本次试验所用溶剂为超纯水，乙醇及内标物正丙醇均能够在水中有较好的溶解，并且超纯水不会干扰乙醇峰与正丙醇峰，同时能够避免对学生身体的危害。但使用水作为溶剂进样，长期使用有可能会导致色谱柱的损伤，缩短色谱柱的寿命，于是在实验中进行了试验条件的改动，在每一次进样检测后，附加一次程序升温，以除去色谱柱杂质并保养色谱柱。

随着初始柱温升高，乙醇色谱峰的保留时间逐渐缩短，出峰前移，乙醇峰与正丙醇峰的分离度也越来越差。为了乙醇峰与正丙醇峰有较好的分离，并且两峰有适宜的保留时间与较好的峰形，以及对色谱柱的保护，本文最终确定了40 ℃作为初始柱温。在试验条件的探究阶段，色谱峰均出现了分叉，拖尾等状况，发现导致这些原因主要与仪器进样口内玻璃内衬管污染和样品浓度过高导致色谱柱超载有关，通过更换新的玻璃内衬管和降低样品浓度，峰形和分离度达到了要求。在实验过程中，必须认真把控每个环节，发现问题，解决问题。

本实验采用气相色谱法，以分组协作方式进行实验。实验操作涉及样品的制备、仪器进样、数据记录与处理等，需要一组同学明确分工，每一组由一部分同学负责供试品溶液的制备，一部分同学负责标准溶液的进样及仪器操作，通力合作，可以高效完成实验。本实验可发挥每个学生在小组中的作用，调动学生参与实验的积极性，培养学生的团队协作精神。同时，本实验气相色谱法采用手动进样法，进样体积仅0.6μL，需要学生熟练掌握微量进样针的用法及进样操作，借此引导学生具备严谨细致的科学态度，确保实验中的每一个环节都正确操作，才能最终获得准确的结果。鼓励学生钻研业务，追求卓越，且此实验用药为学生身边常用药，增加学生学习的兴趣，此实验的设置适合于中药分析学实验教学。