肿瘤细胞三维培养技术研究进展

关冀弛，刘丹，陈艳阁，樊雪，汪海峰*

（1.沈阳化工大学制药与生物工程学院，辽宁 沈阳 110142；2.辽宁成大生物股份有限公司）

抗肿瘤药物的研发依赖于药理学体内及体外病理模型，与体内抗肿瘤试验相比，体外肿瘤细胞培养方便、省时省力、经济实惠，能够清晰地体现肿瘤细胞的生长状态、转移分化、信号传导、基因表达等重要过程，为肿瘤疾病的治疗、药物研发与筛选提供方法和依据［1-2］。

三维细胞培养技术是使细胞在三维空间生长、相互作用，使细胞群形成一个三维立体结构。三维细胞培养有诸多优势：三维细胞培养具有直观性和条件可控性，高度模拟体内微环境［3-4］；可提高细胞培养效率、细胞因子、抗体及其他生物分子等产量，使细胞在三维环境中生长更健康；实验数据如基因表达谱、毒理等与体内研究数据更吻合，可降低药物研发成本和周期［5］。三维细胞培养技术不仅可代替部分动物实验，而且该技术以人体细胞为研究对象，结果更真实准确。目前，肿瘤细胞的三维技术按照有无支架可分为两大类：无支架培养法和支架培养法。

1 无支架培养法

无支架培养是以细胞本身的附着力为基础，使细胞聚集成三维结构。主要包括成球培养法、悬滴培养法、微重力旋转式细胞培养（Rotary cell culture system，RCCS）、磁悬浮培养、超低吸附细胞培养法、生物反应器等。

1.1 成球培养法 成球培养法是将细胞聚集成团状物细胞集合体，在三维环境下形成细胞球［6］。对于肿瘤干细胞，其成球能力是体外鉴定的一个重要方法，该方法可检测单个细胞在特定的生长条件下自我更新能力，所以用细胞成球率表示其成球能力。对于一些胶质瘤和乳腺癌等肿瘤细胞，它们的成球率相对较高，而上皮肿瘤如肝癌细胞或者结肠癌细胞，它们的成球能力相对较低。所以为了研究该类肿瘤细胞的生长能力，就需要提供细胞防止贴壁生长的条件，让肿瘤细胞在特定培养基内成球生长。王静等［7］通过成球培养法研究胰腺癌肿瘤干细胞成球能力，实验结果表明，与普通肿瘤干细胞培养方式相比，成球培养法获得的胰腺癌肿瘤干细胞的CD24、CD44基因表达水平显著提升。张双鹤等［8］通过成球培养法发现了三阴型乳腺癌相关的miRNAs，并检测出microRNA-297及其靶基因SLC7A5在乳腺癌的发病及干性形成具有重要作用。

1.2 悬滴培养法 悬滴培养法是利用表面张力将细胞混悬液置于培养皿或者培养板底部表面制成悬滴，然后翻转培养皿或培养板，使细胞悬挂聚集在液滴底部，利用细胞间的附着力聚集成三维结构［9］。此方法操作比较简便，不需要特别的仪器设备，其缺点是悬滴液体的体积受表面张力限制而局限在50μl以内，且在后续的药物处理及形态观察方面较繁琐，难以用于大规模培养。林鹤等［10］通过悬滴培养法建立三维细胞培养模型，结果表明48孔培养板进行三维细胞培养得到的细胞活性测试更加精准、方便、经济。

1.3 RCCS RCCS是一种通过模拟微重力环境从而使细胞、组织和培养液在一种类似自由落体的状态下旋转运动［11］。该系统可以有效促进各种细胞的增殖和诱导分化，有利于细胞信号通路的传导，同时RCCS无推进器、无搅拌器，故剪切力极低，对细胞几乎无伤害，并且随着细胞团块的增大，可以通过调节转子的旋转速度来降低其沉降率。Tan等［12］研究表明，微重力下显著抑制局部粘着斑激酶（Focal adhesion kinase，FAK）、Rho家族蛋白（RhoA、Rac1和Cdc42）及mTORC1激酶的激活，从而抑制FAK和RhoA信号传导及mTORC1通路，降低黑色素瘤细胞增殖和转移。Strube等［13］运用微重力培养法为人类乳腺癌细胞提供了易于处理、无支架的三维培养模型，证明在微重力下乳腺癌细胞形态、细胞骨架形态和基因表达等方面都有很大的变化，为识别其潜在机制提供新的治疗选择。

1.4 磁悬浮培养 磁悬浮培养是应用噬菌体、磁性氧化铁微粒组成的水凝胶介质进行三维培养，通过对磁场的空间控制，可以控制细胞群的几何形状，且实现不同种细胞在共培养过程中的多细胞聚集［14］。秦文娟等［15］通过悬浮培养肿瘤细胞发现肿瘤细胞的生物钟节律现象，对该方法培养下的肿瘤细胞在不同阶段进行给药处理，结果发现，给药处理后的肿瘤细胞对化疗药物产生明显的时辰反应，有助于生物钟与肿瘤治疗的相关研究。肿瘤细胞做出不同的反应产生药后效果，这对治疗肿瘤细胞及给药方式提供前提。依据该种培养方式，细胞的产率以及生存率提高，可用于细胞大量培养且优势显著。Leonard等［16］利用磁悬浮法测定肿瘤细胞和肿瘤微环境中细胞的特定比率，最快在24 h内形成具有特定细胞成分和密度的肿瘤球，为肿瘤生长机制、营养和药物转运、治疗提供重要实验工具。

1.5 超低吸附细胞培养法 超低吸附细胞培养法采用内表面经惰性超低吸附材料包被处理的圆底培养皿或培养板培养细胞。由于细胞无法吸附在内壁生长，因此细胞聚集黏附成球，形成一定三维结构。此方法操作简便，也不需要额外的仪器设备。然而超低吸附培养皿和培养板的价格昂贵，限制了其方法的广泛使用［17］。

1.6 生物反应器 生物反应器根据具体的培养方法，制作出不同类型的培养设备，它们的温度、湿度、压强、养分、CO2浓度、物理或化学刺激等因素都要极度接近体环境，在设备下的培养比在其他环境中的培养方式更能精准，条件可控，对肿瘤的培养会便捷很多，故而可广泛应用［18］。Manfredonia等［19］通过生物反应器的三维培养系统灌注培养可维持肿瘤组织结构，增殖的肿瘤细胞密度明显高于静态培养，基质细胞和免疫细胞也被保存并完全存活，可高度显示肿瘤微环境的主要特性，为肿瘤药物的评估提供平台。Calamak等［20］设计蠕动连续流生物反应器应用于HCT-116结直肠癌细胞，以模拟循环的流体动力学，这种流动反应器模型可对结直肠癌细胞进行重新编程，使其朝着更具间充质生态位的方向发展，从而模拟血液循环，证明血流动力学可以影响癌细胞的细胞膜成分和形态特征，为癌症治疗提供依据。

2 支架培养法

支架系统主要是将细胞接种或分散于体外可见的细胞外基质支架自组装成三维形态的细胞，这类系统包括水凝胶支架、微流控芯片、固体多孔支架、纤维支架、3D打印法等。

2.1 水凝胶支架 水凝胶支架是在三维空间上搭建孔状结构，使细胞可以在此黏附、生长、迁移。在肿瘤细胞培养过程中，发现了来自天然的水凝胶支架材料，如胶原蛋白，它来自于细胞外基质，性能强大，具有高度的支撑和可塑性，而且易相溶，在哺乳动物体内最多。其他还有人工组织培养的塑料，也有可降解类塑料。不同的细胞培养需要不同的支架材料，所以，三维细胞培养的支架要选择更适合细胞生存、生长、观察、检测等方面的材料，这也是一个重要的培养步骤。基于以上优势，对不同细胞培养方式的差异进行分析，制造出一系列三维胶原支架材料，广泛应用于三维肿瘤细胞培养过程［21-22］。

水凝胶的性质如同人体组织般具有柔软性，同时还赋有弹性、可扩散介质，具有支撑细胞、渗透养分、营养传送的作用。常用的凝胶成分有纤维蛋白、琼脂糖、聚乙烯、乙二醇等物质，但是凝胶支架也有不足之处，如材质和组成的差异，会对营养物质的输入和养分传送产生障碍，不利于细胞培养。Song等［23］合成了一种新的非病毒载体G5-BGG，并将其与shRNA质粒形成基因复合体，G5-BGG/shRNA871负载水凝胶联合替莫唑胺下调CD47蛋白表达，引发骨髓源性巨噬细胞对恶性胶质瘤细胞吞噬功能增强，增加巨噬细胞浸润至残余肿瘤。

2.2 固体多孔支架 固体多孔支架是具有通透性好、密度均匀、孔稀率高的材料支架，且该技术制作简单易得，能够将一些抗生素或者抗氧化剂结合在一起［24-25］。Wang等［26］将含有β-磷酸三钙、2D黑磷纳米片、低剂量盐酸阿霉素和高剂量成骨肽的水/聚乳酸-羟基乙酸/二氯甲烷乳液聚合，低温三维打印成具有分级多孔和机械强度的纳米复合支架，证明具有治疗骨肿瘤切除引起组织缺损的功能。赵培培［27］通过建立r-GdPO4/CS/Fe3O4支架，在红外灯光照射下，使支架温度升高，刺激肿瘤细胞的死亡，并且GdPO4是一种全新的生物活性成分，能够促进血管的生成和成骨能力，对骨肿瘤的治疗带来新希望。

2.3 纤维支架 纤维支架材料主要是应用它们的纤维结构，可为细胞的生长发育提供较大的附着面积，该类支架具有广阔的空隙，为营养物质的交换和气体运输提供方便。该种支架如同加密的蜘蛛网状的空隙可变的三维结构，包括天然纤维支架如蚕丝，合成的纤维支架壳聚糖等［28］。雷冬梅等［29］通过裁剪不同尺寸的聚苯乙烯马来酸酐短纤维支架，研究肝癌细胞在不同尺寸的纤维支架上的增殖与形态，结果表明，在50μm的纤维支架上，肝癌细胞的形态和功能最好。这一支架的建立，对三维肿瘤细胞生长的真实环境给予最大的显示，有助于肿瘤给药测试。Liu等［30］在3D打印的海藻酸盐-明胶水凝胶（Gelatin，Gel）支架上涂复一层均一的聚己内酯（Polycaprolactone，PCL），制备了核/壳纤维支架，PCL涂层可以减少药物从核心凝胶中的自由扩散，随后，将聚多巴胺（Polydopamine，PDA）包复在Gel/PCL核/壳支架上，赋予支架极大的光热效应。由于核心凝胶的热诱导溶胶凝胶转变，本系统实现了近红外激光触发的按需释药。释放的药物（多柔比星）和光热疗法可以在体内外有效地抑制或消融肿瘤，Gel/PCL/PDA核/壳支架具有应用于肿瘤局部治疗和组织再生的潜力，特别是对于那些接受手术切除的癌症患者，可在切除部位植入支架以杀灭残存或复发的癌细胞以及修复手术造成的组织缺损。

2.4 天然支架 天然支架类是由天然物质如胶原、壳聚糖、多糖、海藻盐、细胞外基质等物质材料制备而成［31］。这种材料支架具有高度的生物相容性、可降解和低毒性等优势。只是其结构强度相对较低，没有其他材料支架强度高。近年来壳聚糖纳米粒的兴起，在肿瘤细胞的治疗过程中大显能力。壳聚糖纳米粒可包载药物送至肿瘤细胞内，其外部可进行修饰增加肿瘤细胞可识别的受体或配体，这样可识别肿瘤细胞，释放药物［32］。在壳聚糖纳米粒表面增加叶酸等物质构造叶酸纳米粒，载有紫杉醇、氟尿嘧啶等药物通过内吞作用进入肿瘤细胞，可识别并杀死大量肿瘤细胞［33］。Chaicharoenaudomrung等［34］建立人胶质母细胞瘤细胞培养的3D钙（Ca）-海藻酸盐支架，并研究了其对多柔比星和虫草素两种抗癌药物的反应，结果胶质母细胞瘤细胞增殖减少，瘤球形成增多，肿瘤干细胞基因（CD133、SOX2、Nestin和Musashi-1）表达增强，分化潜能相关基因（胶质纤维酸性蛋白和β-微管蛋白Ⅲ）表达增强，为抗癌药物筛选和肿瘤耐药机制的研究提供了一个很好的平台。

2.5 微球支架 微球支架是一个粒径约数十个到上百个微米之间的球体结构，在它的内部包含着提供细胞生长的因子、促进细胞增殖分裂的营养所需［35］。通过改变微球的制备条件或在微球中加入肝脏脱细胞基质等活性成分，可提高微球支架的传质能力，使其更接近与体内环境，促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。孙东升［36］构造海藻酸钙凝胶微球模型，通过调整微球凝胶浴的浓度，改变微球的传质能力，发现微球传质能力的提高可促进肝癌细胞的增殖，又引入肝脏脱细胞基质成分，发现细胞的基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的活性增强，表明细胞的转移侵袭能力提高，为探究肝癌细胞的迁移侵袭机制、研发高效抗癌药物提供依据。

2.6 微流控芯片 微流控芯片是在玻璃、硅等基底上雕刻出微米甚至纳米级的通道及分析检测单元，实现微量样品分析、细胞培养和信号传导等功能的微型技术平台，内部具有能通过流体、反应操作平台、分析检测、分离等一系列操作的类似于整个化学实验室的功能，并且它的大小与血管尺寸相近，芯片具有控制流体流动、减少试剂损耗、检测速度加倍、节省时间等优点优势，可充分模拟体内微环境，对肿瘤细胞的培养提供帮助［37］。乔苗苗等［38］通过制作聚二甲基硅氧烷双层芯片进行细胞培养，结果表明，微流控芯片的独特结构与特征作用下，大大促进了细胞的聚集，使细胞存活率达80%。Gwak等［39］研制新型的微流控芯片，可高效、及时地选择性分离肿瘤来源的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），EVs可以用来生成评估肿瘤转移风险的补充方法上皮间质转化指数，结果显示每100μl进样量6.7 min内可选择性分离出90%以上表达上皮标志物和间充质标志物的EVs，这一技术的广泛研究与开展，对肿瘤细胞的生长、耐药性质、转移扩散等研究提供重要意义。

2.7 3D打印法 3D打印法使用专门的打印机来创建固体物件，通过计算机进行设计，分析所需支架的材质、形状、尺寸、结构等方面内容，这样再通过一系列的程序加工制造，得到一个实体的材料［40］。三维打印技术将三维立体打印机与计算机结合，将所需材料投入机体内，在计算机的控制下将打印机内部的材料喷射出，这样一层层地叠加起来，形成实体物件。当下3D打印法广泛应用于各类物品制作行业，利用该方法可定制出各类的支架结构。该类型培养方法对计算机和打印机的要求较高，价格昂贵，故目前应用较少。3D打印法也可与其他支架材料结合，共同应用于肿瘤细胞的培养和活性检测过程，可增加支架的强度、韧性、无毒等优势。Ong等［41］通过制作3D打印微流控细胞培养装置，对口腔鳞状细胞癌肿瘤和肝癌细胞球体进行无泵灌注培养，证明了3D打印设备的生物学性能且该装置能够直接固定和维持3D多细胞球体的活力和功能。

3 肿瘤细胞三维培养技术应用

肿瘤细胞三维培养技术可应用于肿瘤细胞培养、肿瘤疾病发病机制、转移、侵袭、复发以及治疗方案的研究和药物研发、筛选等。

3.1 肿瘤生物学行为 肿瘤细胞三维培养技术可研究肿瘤细胞的侵袭转移、基因表达、蛋白表达等诸多方面，更清晰准确地观察记录肿瘤细胞生长与发展过程。通过长期动态的观察和追踪，为肿瘤细胞的培养方法、迁移行为、生物学特性、药物研发与筛选等提供依据［42］。Poggi［43］在三维培养系统中培养结直肠癌细胞，研究肿瘤细胞表型和生长的程序，结果表明，在光学显微镜下观察到三维培养的结直肠癌细胞在超低贴壁培养板中呈多细胞聚集式生长，逐渐形成细胞球体，可清晰观察到肿瘤细胞生长形态。

3.2 肿瘤新生血管形成 肿瘤血管生成是在肿瘤微环境诱导下在原有血管基础上形成以毛细血管为主的血液系统，并在肿瘤组织内建立血液循环的过程［44］。该过程需要细胞、细胞质基质、信号传导系统的共同运作，肿瘤细胞三维培养技术可提供与体内血管组织高度吻合的新生血管系统，这有利于在体外开展肿瘤迁移、侵袭方面研究。Valipour等［45］分离了来源于人子宫内膜间充质干细胞（hEnMSCs）的外泌体，研究以hEnMSCs外泌体作为阿托伐他汀的载体，在三维共培养下人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和U87胶质母细胞瘤球体的促凋亡和抗血管生成作用，结果表明，负载阿托伐他汀的hEnMSCs外泌体对胶质母细胞瘤细胞具有较强的抗肿瘤作用，且该方法增强了阿托伐他汀促肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤血管生成能力，为胶质母细胞瘤的治疗提供了新的前景。

3.3 肿瘤干细胞 肿瘤干细胞以自我复制和多项细胞分化引起肿瘤的生长、增殖、转移和复发。从本质上讲，肿瘤干细胞自我更新和无限增殖维持肿瘤细胞群的活力。肿瘤干细胞的运动和迁徙可能导致肿瘤细胞的转移，肿瘤干细胞可长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子，而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感［46-47］。Monzur等［48］通过三维培养建立肿瘤干细胞模型，将二苯基氯化碘盐（diphenyleneiodonium chloride，DPI）作用于肿瘤干细胞中，结果表明DPI是肿瘤干细胞靶向线粒体呼吸的合适候选物，与传统的二维培养体系的贴壁单分子层相比，三维培养方法更有效地筛选抗肿瘤干细胞药物候选物，更好地模拟肿瘤微环境。

3.4 肿瘤微环境 肿瘤微环境由多种细胞成分组成，包括内皮细胞、成纤维细胞、周细胞、脂肪细胞、免疫细胞等，复杂多样且易于变化，与肿瘤的产生、生长和转移密切相关［49］。肿瘤微环境可促进原癌基因和肿瘤生长蛋白的表达，又可抑制免疫细胞发挥免疫功能，肿瘤与微环境之间相互调节、相互作用，通过对肿瘤与微环境关系的研究，对肿瘤生物学行为、诊断和治疗都会产生重要意义［50］。Baru等［51］利用新型AXTEX-4D平台建立三维组织样体模型，结果表明肿瘤三维组织样细胞显示了三维细胞培养的基本特征，具有快速附着和增殖能力且细胞寿命更长，细胞骨架和缺氧核心相连。该研究还表明，与二维单层细胞培养相比，3D-MCF-7组织样细胞具有更大的耐药性，三维组织样细胞在模拟重要的肿瘤特征、肿瘤微环境、抗凋亡特征及其产生的耐药性方面比二维培养细胞更强。

3.5 抗肿瘤药物研发与筛选 检验候选药物的安全性一般利用体外实验进行研究，体外实验可以检测给药后靶细胞的受损程度、毒副作用、安全性等。药物的作用价值直接在靶细胞的损伤程度上体现出来，在检测过程中，安全性实验可体现候选药物的毒副作用和其他不良结果。肿瘤细胞三维培养下的细胞形态、基因表达、转移侵袭，以及其他生理过程近似于体内微环境，故而三维细胞培养技术可应用于肿瘤药物筛选，此过程效率、安全性更高且结果更准确。Rosendahl等［52］在3D TEMPO-CNF支架中培养乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231，在光学显微镜下观察到肿瘤细胞以不同形态呈多层生长；基因表达分析表明，相较于二维培养，三维TEMPO-CNF支架诱导MCF7细胞中的干细胞标记CD44和迁移标记VIM和SNAI1升高，TEMPO-CNF被证明是一种有前景的三维细胞培养模型材料，可用于抗肿瘤药物筛选。

4 小结

三维培养技术以体外培养技术极大程度地模拟体内细胞生存的环境，这种环境是细胞生存和生长所必需，用以维持细胞正常的生理代谢功能，其组成也复杂多样。然而这种细胞生长的微环境成分变化也导致细胞发生异常，容易引起死亡或凋亡。肿瘤细胞的三维培养，能更清晰地观察出肿瘤组织的生长特征，对其新生血管形成、生理相关的信号通路、基因表达、细胞-基质和细胞-细胞相互作用等方面提供更有力的证据，同时三维培养技术也会推动解剖生理学、细胞生物学等领域的研究，具有广泛的应用前景。

目前，肿瘤细胞三维培养技术仍存在一定缺陷，一些技术由于制作材料复杂、成本过高、操作困难等诸多因素未能够全面开发应用，并且该技术始终不能完全模拟体内环境。随着科技的不断发展，肿瘤细胞三维培养技术会日趋完善，相信会开发出更多成熟、应用型技术，为肿瘤疾病的发病机制、转移复发、药物研发和筛选提供方法和依据。