PEAR1、ApoE基因多态性与AMI患者易感性及临床特征的相关性分析

王黎阳，袁义燕，詹雯，齐林

（郑州市第七人民医院心电图科，郑州 450016）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）具有高发病率和高死亡率，是目前威胁人类健康的主要疾病之一。尽管随着介入治疗的发展，心肌再灌注明显提升，但住院患者病死率仍达11%左右，而在存活出院的AMI首次发作患者中1年内再次AMI发生率为10%~30%[1]。目前已证实AMI具有家族遗传因素，另外不良膳食结构、情绪紧张、肥胖、吸烟、高血压、糖尿病等均会增加AMI患病风险[2]。近年来，基因多态性与AMI易感性的关系逐渐受到临床关注。有研究发现在心脑血管疾病患者中，血小板内皮聚集受体-1[3]（platelet endothelial aggregation receptor-1，PEAR1）、载脂蛋白E[4]（apolipoprotein E，ApoE）的基因型分布存在差异，PEAR1、ApoE基因多态性与动脉粥样硬化和血脂代谢紊乱具有一定关联，进而影响心脑血管疾病的发生、发展，但PEAR1、ApoE基因多态性与AMI患者易感性是否存在关联尚需进一步证实。故本研究分析PEAR1、ApoE基因在AMI患者以及健康人群中的分布特征，并探讨PEAR1、ApoE基因多态性与AMI患者易感性及临床特征的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究为病例对照研究，选取2019年1月—2021年2月心内科收治的AMI患者183例（病例组）。纳入标准：（1）符合AMI的诊断标准[5]，患者有典型胸痛症状，休息或含服硝酸甘油无法缓解，且经心电图、心肌损伤标记物确诊为AMI。（2）年龄≥18岁。（3）病例资料完整。（4）进行PEAR1、ApoE基因多态性检测。排除标准：（1）合并除AMI以外的其他类型心脏病。（2）合并脑血管疾病、肝肾功能不全、严重内分泌疾病、免疫系统疾病、血液病、感染性疾病、恶性肿瘤。（3）研究近期3个月内参与其他临床研究。同期选取无AMI病史的中老年志愿者92例（对照组）。本研究符合《赫尔辛基宣言》原则，不违背医学伦理，经伦理委员会批准（文件备案号：20181014），研究对象均签署知情同意书，自愿参与研究。

1.2 方法 试剂：人类PEAR1基因多态性检测试剂盒（实时荧光PCR法），购自福州艾迪康医学检验实验室有限公司。人类ApoE基因多态性检测试剂盒（实时荧光PCR法），购自厦门人瑞生物医药科技有限公司。血液DNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司。仪器：Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪，购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司。MassARRAY DNA质谱基因分析仪，购自美国Thermo Fisher公司。

采集外周静脉血5 L，置于-20℃冰箱保存。参照血液DNA提取试剂盒说明书，将冰冻的血液融化后，取1 mL血样依次加入等体积的PBS磷酸盐缓冲液，12 000 r/min离心5 min，弃上清；再加入10 μL的20 mg/mL的蛋白酶K，55℃水浴10 h；再加入等体积的Tris饱和酚，离心；将上层水相转入另一2 mL离心管中加入等体积的Tris饱和酚，离心；再加入等体积的氯仿异戊醇，离心；再加入2倍体积的冰乙醇，可见絮状DNA析出；冰浴20 min，再次12 000 r/min离心10 min，沉淀DNA，真空干燥，备用待检。PEAR1基因多态性检测的原理为利用特异性引物对突变靶序列进行扩增，同时阻滞野生型基因序列的扩增，使用TaqMan探针检测扩增产物，检测PEAR1基因上的rs2768759位点。将PEAR1试剂盒上的试剂冰上融化，离心，设置阳性与阴性对照，每个1.5 EP管加入19.7 μL反应液、0.3 μL Taq DNA聚合酶、5 μL待检DNA等，参考说明书操作步骤。将PCR反应管置于实时荧光定量PCR仪中反应。设置PCR扩增程序：95℃5 min，95℃20 s，57℃32 s，5个循环，95℃20 s，60℃32 s，40个循环，4℃冷却结束，收集FAM信号。人类ApoE基因多态性检测原理：人类ApoE基因有3种等位基因型ε2、ε3和ε4，检测rs429358和rs7412两个单核苷酸多态性位点，参考说明书操作步骤。

1.3 资料收集 通过查阅医院电子病例系统，收集患者基本资料，包括：性别、年龄、是否肥胖、吸烟史、是否高血压、是否糖尿病、是否高脂血症、是否高同型半胱氨酸（Hcy）血症、冠心病家族史。肥胖[6]定义为体重指数≥28 kg/m2，体重指数=体重/身高2。高血压[7]、糖尿病[8]、高脂血症[9]、高Hcy血症的定义参考相关指南。比较病例组与对照组的基本临床资料，比较病例组与对照组的PEAR1基因型和ApoE基因型的频率分布，分析PEAR1基因型和ApoE基因型分布与基本临床资料的相关性，进行AMI易感性的多因素分析。

1.4 统计学处理 使用SPSS 22.0统计学软件。所有计量资料均符合正态性检验，以±s表示，两组比较采用独立样本t检验。不符合正态分布的，使用中位数（四分位间距）。基因型频率为计数资料，以n（%）描述，两组比较采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例组与对照组的临床资料比较 病例组与对照组的性别、年龄、冠心病家族史比较无显著差异（均P＞0.05）。病例组肥胖、吸烟史、高血压、糖尿病、高脂血症、高Hcy血症的比例高于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 病例组与对照组的临床资料比较[n（%），±s]Tab 1 Comparison of clinical data between the case group and the control group[n（%），±s]

表1 病例组与对照组的临床资料比较[n（%），±s]Tab 1 Comparison of clinical data between the case group and the control group[n（%），±s]

注：Hcy：同型半胱氨酸

指标 病例组（n=183） 对照组（n=92） χ2/t P性别男117（63.93） 55（59.78） 0.450 0.502女66（36.07） 37（40.22）年龄（岁） 60.27±8.26 59.02±8.13 1.190 0.235肥胖 41（22.40） 8（8.70） 7.857 0.005吸烟史 37（20.22） 9（9.78） 4.787 0.029高血压 93（50.82） 13（14.13）34.790＜0.001糖尿病 46（25.14） 7（7.61） 12.089 0.001高脂血症 51（27.87） 8（8.70） 13.355＜0.001高Hcy血症 54（29.51） 10（10.87）11.911 0.001冠心病家族史 20（10.93） 7（7.61） 0.762 0.383

2.2 病例组与对照组的PEAR1基因型频率分布比较 病例组、对照组的PEAR1基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（P=0.998，P=0.708）。病例组GG基因型频率低于对照组，AA基因型频率高于对照组（均P＜0.05）。病例组G等位基因频率低于对照组，A等位基因频率高于对照组（均P＜0.05），见表2。

表2 病例组与对照组的PEAR1基因型频率分布比较[n（%）]Tab 2 Comparison of PEAR1 genotype frequency distribution between the case group and the control group[n（%）]

2.3 病例组与对照组的ApoE基因型频率分布比较 病例组ε3/ε3基因型频率低于对照组，ε2/ε2、ε2/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4基因型频率均高于对照组（均P＜0.05）。病例组ε3等位基因频率低于对照组，ε2、ε4等位基因频率高于对照组（均P＜0.05），见表3。

表3 病例组与对照组的ApoE基因型频率分布比较[n（%）]Tab 3 Comparison of ApoE genotype frequency distribution between the case group and the control group[n（%）]

2.4 PEAR1基因型与AMI临床特征的关联 在AMI患者中，GG基因型、GA基因型、AA基因型患者的性别、年龄、肥胖、吸烟史、高血压、糖尿病、高脂血症、高Hcy血症、冠心病家族史比较均无显著差异（均P＞0.05），PEAR1基因型与AMI临床特征无明显关联，见表4。

表4 PEAR1基因型与AMI临床特征的关联[n（%）]Tab 4 Association of PEAR1 genotypes with clinical characteristics of AMI[n（%）]

2.5 ApoE基因型与AMI临床特征的关联 在AMI患 者 中，ε3/ε3、ε2/ε4、ε2/ε2、ε2/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4基因型患者的性别、年龄、肥胖、吸烟史、高血压、糖尿病、高Hcy血症、冠心病家族史比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。ApoE基因型与高脂血症有关联，ε3/ε3基因型患者中高脂血症的比例低于ε2/ε4、ε2/ε2、ε2/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4基因型患者，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表5。

表5 ApoE基因型与AMI临床特征的关联[n（%），±s]Tab 5 Association of ApoE genotypes with clinical characteristics of AMI[n（%），±s]

表5 ApoE基因型与AMI临床特征的关联[n（%），±s]Tab 5 Association of ApoE genotypes with clinical characteristics of AMI[n（%），±s]

注：ApoE：载脂蛋白E；AMI：急性心肌梗死

指标 ε3/ε3基因型（n=77）ε2/ε4基因型（n=9）ε2/ε2基因型（n=18）ε2/ε3基因型（n=28）ε3/ε4基因型（n=35）ε4/ε4基因型（n=16） χ2/t P性别男47（61.04） 6（66.67） 10（55.56） 16（57.14） 30（85.71） 8（50.00） 9.965 0.076女30（38.96） 3（33.33） 8（44.44） 12（42.86） 5（14.29） 8（50.00）年龄（岁） 58.45±8.22 58.37±8.05 60.16±8.10 62.03±7.85 61.86±7.49 63.66±7.96 2.028 0.077肥胖 15（19.48） 1（11.11） 6（33.33） 7（25.00） 8（22.86） 4（25.00） 2.450 0.784吸烟史 10（12.99） 3（33.33） 6（33.33） 6（21.43） 10（28.57） 2（12.50） 7.505 0.186高血压 31（40.26） 7（77.78） 9（50.00） 16（57.14） 20（57.14） 10（62.50） 7.939 0.160糖尿病 13（16.88） 3（33.33） 6（38.89） 8（28.57） 10（28.57） 5（31.25） 5.630 0.344高脂血症 8（10.39） 2（22.22） 6（33.33） 14（50.00） 16（45.71） 5（31.25） 24.571 ＜0.001高Hcy血症 19（24.68） 2（22.22） 7（38.89） 9（32.14） 11（31.43） 6（37.50） 2.503 0.776冠心病家族史 5（6.49） 1（11.11） 2（11.11） 4（14.29） 5（14.29） 3（18.75） 3.292 0.655

3 讨论

目前研究发现，PEAR1基因通过调控磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路来影响血小板活化和聚集作用[10]。国内外对PEAR1基因多态性的研究尚处于起步阶段，PEAR1基因单核苷酸多态性（SNP）位点包括rs2768759位点、rs12041331位点、rs9550270位点等[11-12]，其中与心脑血管疾病相关的SNP位点以rs2768759位点的研究较为成熟，GG基因型为野生型，GA基因型为杂合突变型，AA基因型为纯合突变型。本研究分析PEAR1基因多态性与AMI易感性的关联，结果发现病例组GG基因型频率低于对照组，AA基因型频率高于对照组，病例组G等位基因频率低于对照组，A等位基因频率高于对照组。上述说明PEAR1基因A等位基因突变增加AMI易感性，这与Yao等[13]研究观点基本一致。PEAR1基因多态性影响AMI发生、发展的机制尚不明确，可能与PEAR1突变基因型下调血小板PEAR1表达从而改变血小板聚集功能并引起血管内皮功能障碍有关。研究显示，PEAR1基因多态性与心血管事件死亡率存在相关性，其中AA突变基因型人群的心血管事件死亡风险远高于GG野生型人群[14]。

ApoE蛋白在脂类代谢中具有重要作用，直接参与脂蛋白的合成、分泌、加工、运输。本研究分析ApoE基因多态性与AMI易感性的关联，结果发现病例组ε3/ε3基因型频率低于对照组，ε2/ε2、ε2/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4基因型频率均高于对照组，而且病例组ε3等位基因频率低于对照组，ε2、ε4等位基因频率高于对照组。上述说明ApoE基因ε2、ε4等位基因突变增加AMI易感性，这与李新等[15]研究观点基本一致。有研究发现，与ε3/ε3野生型基因相比，ε2/ε4突变型基因人群AMI患病风险增加37%，ε3/ε4突变型基因人群AMI患病风险增加90%，ε4/ε4突变型基因人群AMI患病风险增加2.18倍。ApoE基因多态性影响AMI发生发展的机制尚不明确，可能与ApoE基因突变引起的高脂血症有关。既往研究发现，ε3等位基因具有正常脂代谢调控作用，当ApoE基因突变时，无法正常参与脂代谢，血浆中血脂积累增多，沉积在血管壁形成粥样斑块，引起动脉粥样硬化[16]。ε2等位基因是Ⅲ型高脂蛋白血症的高危基因，ε4等位基因升高血浆胆固醇水平，增加动脉粥样硬化风险。本研究也发现，ApoE基因多态性与性别、年龄、肥胖、吸烟史、高血压、糖尿病、高Hcy血症、冠心病家族史无关联，但与高脂血症有关联，ε3/ε3基因型患者中高脂血症的比例低于携带ε2、ε4的突变基因型患者。目前研究已经证实ε2、ε4等位基因在高脂血症以及动脉粥样硬化中的病理作用[17]。ApoE基因多态性通过影响脂代谢进而影响AMI的发生和预后，具体的调控通路仍待研究探讨。

综上所述，PEAR1、ApoE基因多态性与AMI易感性有一定关联，PEAR1基因A等位基因突变增加AMI易感性，ApoE基因ε2、ε4等位基因突变与高脂血症有关。通过检测PEAR1、ApoE基因，有助于及时了解患者的基因缺陷和患病风险，为疾病的早知道、早预防、早治疗提供了可能，从而进行健康的生活干预，降低疾病的发生风险。对于确诊患者，通过检测PEAR1、ApoE基因可以从分子基因学上准确地找到患病根源，还可以根据不同的基因多态性选择最佳的治疗方案，更科学地指导患者使用药物的种类和剂量，从而提高治疗效果。