脱氧雪腐镰刀菌烯醇对仔猪免疫球蛋白、胸腺和脾脏抗氧化力的影响及植物炭黑的干预作用

吴 杰，邓 波，陈雪颖，王翰阳，张 城，林瑞平，沈亚菊，徐子伟*

（1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州 310021；2.东北农业大学动物科学与技术学院，黑龙江哈尔滨 150000；3.杭州正兴牧业有限公司，浙江杭州 311301；4. 平湖市畜牧兽医站，浙江嘉兴 314200）

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Dеoxynivalеnol，DON）是镰刀菌在生长过程中产生的一种有毒次级代谢产物，属于B 型非大环类单端孢霉烯族毒素的一种。DON 广泛存在于谷物及其制品中，并且DON 化学性质稳定，研磨、加热、高压等处理均很难将其破坏，全球每年因DON 污染谷物而造成的经济损失可达数十亿美金。免疫系统是DON 攻击的主要对象。研究表明，DON被肠道吸收后会随着血液快速进入胸腺、脾脏等免疫器官，影响细胞增殖并引发凋亡，造成氧化损伤，DON还会抑制机体的免疫系统对病原体做出免疫应答，影响疫苗接种效果，导致猪群爆发疾病。在日粮中添加吸附剂是缓解DON 对机体损害的一种常见的方法，然而由于DON 极性及亲电性较弱，大多数吸附剂对其吸附效果很低。植物炭黑是以天然植物、壳等为原料经高温碳化、活化后得到，主要成分为碳，有效孔径为3.56 nm，比表面积1 440.09 m/g，孔体积为1.28 cm/g，是一种活性炭类吸附剂，该类吸附剂具有较大的比表面积及较强静电吸附力，对毒素有很好的吸附效果，在体外缓冲液体系中对DON 吸附率能达到84% 以上，然而关于植物炭黑在体内应用效果的研究还较少。本课题组前期研究发现0.1% 植物炭黑能抑制DON 对仔猪生产性能的降低，本试验在此基础上进一步研究添加植物炭黑对饲喂DON 污染饲粮仔猪疫苗抗体水平、血清免疫球蛋白和胸腺、脾脏抗氧化力的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料 植物炭黑由福建百草霜生物科技有限公司提供。

1.2 试验设计 试验选取48 头24 日龄的健康杜大长断奶仔猪（公猪），平均体重为（7.76±0.24）kg，按照体重随机分为4 组，分别饲喂基础饲粮（CTR组）、基础饲粮+0.1% 植物炭黑（PCB 组）、基础饲粮+1.5 mg/kg DON（DON 组）、基础饲粮+1.5 mg/kg DON+0.1%植物炭黑（PD 组），每组12 头仔猪分3 栏，每栏4 头，每头仔猪为1 个重复单位，试验期21 d。

1.3 饲养管理与试验日粮 本试验在浙江省杭州正兴牧业有限公司内进行，所有栏舍为封闭式、漏缝地板。每日07:00、12:00、18:00 饲喂饲料，每次饲喂遵循少量多次原则，至下次饲喂余料基本没有，自由饮水，免疫程序按照猪场常规方法进行。每天对圈舍进行清扫，定期对猪舍进行消毒。试验期早晚观察仔猪精神状态。

基础饲粮参照NRC（2012）猪营养需要配置，饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

1.4 测定指标与方法

1.4.1 血清生化指标及疫苗抗体的测定 试验第10 天和第21 天，08:00 对所有仔猪进行采血，静置30 min 后3 000 r/min 离心10 min，分离得到血清，置于-20℃保存，用于测定测定免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM），测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。第21 天血清同时测定猪瘟抗体、圆环2 型抗体及口蹄疫O 型抗体，测定试剂盒购自爱德士公司（IDEXX）。

1.4.2 胸腺、脾脏抗氧化指标的测定 试验第21 天，每栏随机挑选2 头仔猪进行屠宰采样。仔猪采样电击致死后放血，分离胸腺和脾脏，装入冻存管后立即放入液氮中速冻待测。脾脏及胸腺超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性严格按照试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书进行测定。

1.5 统计分析 所有试验数据以个体为重复经Excеl 2019初步分析后，使用SPSS17.0 软件对4 组数据进行双因子方差分析，当有显著互作效应或有显著互作效应趋势时，采用LSD 多重比较检测4 组间的显著性。数据以平均值±标准差表示，以<0.05 为差异显著，以0.05<<0.1 为有显著性趋势。

2 结果与分析

2.1 植物炭黑对饲喂DON 污染饲粮仔猪血清疫苗抗体的影响 如表2 所示，饲粮添加1.5 mg/kg DON 或0.1%植物炭黑对仔猪21 d 血清猪瘟抗体、2 型圆环抗体、O型口蹄疫抗体各无显著影响。

表2 植物炭黑对饲喂DON 污染饲粮仔猪疫苗抗体水平的影响（n=12）

2.2 植物炭黑对饲喂DON 污染饲粮仔猪血清免疫球蛋白的影响 如表3 所示，饲喂1.5mg/kg DON 污染饲粮降低了第10 天仔猪血清IgA、IgG、IgM 及第21 天IgG 含量（<0.05），并有降低第21 天血清IgA 含量的趋势（0.05<<0.1），饲粮中添加0.1% 植物炭黑对仔猪血清免疫球蛋白无显著影响。DON 和植物炭黑对血清第10 天IgG 有互作效应趋势（0.05<<0.1），对第21 天IgG 有显著互作效应，多重比较结果显示，较CTR 组相比，DON 组血清 第10 天 及21 天IgG 含 量显著降低，饲粮中添加0.1% 植物炭黑能缓解DON 对血清IgG 的影响，PD 组第10 天及第21 天IgG 含量与CTR 无显著差异。

表3 植物炭黑对饲喂DON 污染饲粮仔猪血清免疫球蛋白的影响（n=12） g/L

2.3 植物炭黑对饲喂DON 污染饲粮仔猪胸腺、脾脏抗氧化指标的影响 如表4 所示， DON 会显著增加胸腺MDA 含量，显著降低脾脏T-AOC、CAT 含量，并有降低脾脏GSH-Px 含量的趋势（0.05<<0.1）。饲粮中添加0.1%植物炭黑对仔猪胸腺及脾脏抗氧化指标无显著影响。DON 刺激及添加植物炭黑对胸腺SOD 及脾脏CAT 活性有显著互作效应，对胸腺MDA 及脾脏GSHPx 有互作效应趋势（0.05<<0.1），多重比较结果显示，DON 组仔猪的胸腺MDA 含量较CTR 组、PCB 组显著增加，且其胸腺SOD 及脾脏GSH-Px 含量较CTR 组显著降低。饲粮中添加0.1% 植物炭黑能缓解DON 对胸腺及脾脏的氧化损伤，PD 组仔猪胸腺SOD、MDA 含量及脾脏CAT、GSH-Px 含量较CTR 组仔猪无显著差异。

表4 植物炭黑对饲喂DON 污染饲粮仔猪胸腺、脾脏抗氧化指标的影响（n=6）

3 讨 论

动物可以通过接种疫苗来获得对某些疾病的抗性，然而包括DON 在内的多种霉菌毒素可通过细胞免疫、体液免疫来影响机体免疫系统，增加对病毒、细菌、寄生虫等的易感性，从而影响疫苗的接种效率。Savard 等研究发 现，2.5 mg/kg 或3.5 mg/kg的DON 污染饲粮会降低仔猪蓝耳病毒疫苗中病毒在体内的复制，从而降低疫苗接种效率。DON 对疫苗接种的影响和DON 浓度有关，Yunus 等在肉鸡中发现低浓度DON（1.68 mg/kg DON）对新城疫、传染性支气管病毒、传染性法氏囊病毒抗体滴度无显著影响，只有高浓度DON（12.21 mg/kg）才能显著提高新城疫病毒抗体滴度，降低传染性支气管炎病毒抗体滴度。本研究中仔猪采食1.5 mg/kg DON 污染饲粮后血清抗体并无显著变化，这可能是由于DON暴露时间偏短，有研究表明无论低浓度（1 mg/kg）或高浓度（3 mg/kg）DON 刺激仔猪都需要28 d 才会显著影响血清中抗体滴度，而本试验期为21 d，DON对疫苗接种的效果可能还未显现。在霉菌毒素污染饲粮中针对性添加吸附剂是降低毒素对机体免疫损伤的有效方法。Zhang 等发现饲料中添加水合钠钙铝硅酸盐能有效缓解DON 引起的猪血清中圆环抗体滴度下降。刘宁在饲喂自然霉变饲粮的仔猪中也发现，添加0.1%或0.25%的酵母细胞壁能显著提高血清中猪瘟抗体效价，使其达到正常水平。本试验中，在正常饲粮或DON 污染饲粮中添加植物炭黑对血清疫苗抗体均未产生显著影响，这从侧面反映植物炭黑并不会主动性影响疫苗接种效果，预防性添加是较为安全的。

免疫球蛋白是动物发挥体液免疫应答重要的免疫分子，其含量可反映动物机体免疫性能。根据暴露时间及剂量的不同，DON 可能对机体表现免疫抑制或免疫激活作用。研究表明低剂量的DON 会上调细胞因子表达，激活免疫系统，增加IgA、IgG 等免疫球蛋白含量，而高剂量DON 会引发白细胞凋亡，降低免疫球蛋白含量，抑制机体免疫。本试验中，断奶公猪饲喂1.5 mg/kg DON 污染饲粮第10 天血清IgA、IgG 及IgM 含量便出现显著降低，这提示在此试验条件下，DON 抑制了仔猪免疫应答，降低机体抵抗力，结果与Wang 等研究一致，其在体外试验中发现，将脾脏淋巴细胞暴露在0.1～0.8 μg/mL DON 培养基 中，12、24、48 h 细胞中IgG 及IgM 显著降低，并且效果和DON 剂量呈正相关。杨婉莹在断奶仔兔中也发现，灌服0.5 mg/kg BW 或1.5 mg/kg BW DON 31 d 均会降低血清中IgA、IgG、IgM 含量，高浓度效果更显著。本试验中，在霉变饲粮中添加植物炭黑以求其降低DON 对机体的免疫毒性，本次仔猪体内试验显示，在DON 污染饲粮中添加0.1%植物炭黑能有效抑制DON 引起的血清IgG 降低，免疫球蛋白水平与正常仔猪无显著差异，说明植物炭黑能在体内有效吸附DON，缓解DON 对机体的免疫抑制，结果与刘宁使用酵母细胞壁结果相一致。另外Chu 等研究发现在正常饲粮中添加活性炭类吸附剂能增强机体免疫功能，提高仔猪血清中IgG、IgM 水平，然而本研究未发现这种影响，这表明在本试验条件下，正常饲粮中添加植物炭黑不会影响机体的体液免疫。

脾脏及胸腺是动物机体重要的免疫器官，胸腺是T 淋巴细胞分化成熟的中枢免疫器官，能诱导胸腺细胞分化成熟为功能不同的T 细胞亚群，而脾脏是体内最大的免疫器官，是T 细胞和B 细胞产生免疫应答的重要场所。胸腺是对DON 最敏感的组织器官之一，DON 能快速激活胸腺中T 细胞受体并引起胸腺细胞阴性选择。Zhang等在断奶仔猪中发现，DON 会引起胸腺组织病变，加速细胞凋亡，并破坏其原有氧化-抗氧化系统平衡。DON 吸收后也会快速进入脾脏组织，Pеstka 等研究发现小鼠急性暴露在DON 下会增加促炎因子的释放，对脾脏造成氧化损伤。Wang 等使用0.1、0.2、0.4、0.8 μg/mL DON 作用于 脾脏细 胞，细胞中GSH-Px、SOD、CAT 含量显著下降，MDA 含量显著增加，并且效果与DON 剂量及作用时间呈正相关。陈群等在仔猪中也发现，饲喂多种镰刀菌毒素混合污染（DON、烟曲霉毒素、玉米赤霉烯酮）的饲粮会显著降低断奶仔猪脾脏中GSH-Px 及SOD 含量，显著增加MDA 含量。与之前研究结果一致，本研究也发现DON 的摄入增加了胸腺MDA 含量，降低了脾脏T-AOC、CAT 含量，并有降低脾脏GSH-Px 含量的趋势，表明DON 打破了免疫组织原有的氧化-抗氧化稳态系统，引起免疫器官的氧化应激反应。目前国内外有关吸附剂缓解DON 对免疫器官损伤的研究还较少，叶飞在仔猪中发现添加吸附剂能缓解DON 引起的脾脏肿大，降低脾脏指数。Zhang 等研究表明水合钠钙铝硅酸盐能降低DON 引起的胸腺组织病理损伤并抑制抗氧化指标代偿性增加，减缓脾脏细胞凋亡，降低氧化损伤。与之前研究相一致，本试验在DON 污染饲粮中添加0.1% 植物炭黑后，脾脏和胸腺各抗氧化指标均与对照组相比无显著差异，这可能是因为植物炭黑这种活性炭类吸附剂能有效在肠道吸附DON，降低DON 的吸收，从而减少DON 及其代谢产物在免疫器官的含量，降低对免疫器官的氧化损伤。另外单独添加植物炭黑对胸腺、脾脏的抗氧化指标未见显著差异，说明单独添加植物炭黑对免疫器官不会造成损伤，与Wang 等的结果一致。

4 结 论

在本试验条件下，饲粮中添加0.1%植物炭黑能有效抑制DON 引起的血清免疫球蛋白下降，减轻胸腺及脾脏的氧化应激，从而缓解DON 对仔猪免疫系统的损伤。单独添加植物炭黑并不会对机体疫苗接种效果、免疫球蛋白及免疫器官的抗氧化性能造成负面影响。