王志鹏,陈丽君,唐 海,周 微
(江苏天士力帝益药业有限公司,天津 300410)
1,2,3-三乙酰氧基-5-脱氧-β-D-核糖是合成卡培他滨的关键中间体,其以D-核糖为原料,经过一系列反应合成 5-脱氧-β-D-核糖,再经过甲酰化得到[1-3]。因此,D-核糖与 5-脱氧-β-D-核糖是 1,2,3-三乙酰氧基-5-脱氧-β-D-核糖中潜在的杂质,需要建立分析方法进行研究。糖类物质多见于采用液相色谱-示差检测器进行常量检测[4-6],作为杂质的检测文献报道较少[7-8]。本研究建立了以示差折光液相色谱法检测1,2,3-三乙酰氧基-5-脱氧-β-D-核糖中的 D-核糖以及5-脱氧-β-D-核糖,方法简便可靠,灵敏度高,具有重要的意义。
1.1 仪器 Agilent 1260 液相色谱仪(配示差折光检测器,美国安捷伦公司),chromeleon 7 色谱工作站(美国赛默飞公司);XS105DU 电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);超纯水系统(Millipore-Q,Millipore 公司)。
1.2 试药 1,2,3-三乙酰氧基-5-脱氧-β-D-核糖(连云港海恒生化科技有限公司,批号20180429、20180510、20180512、20180601、20180602、20180603);D-核糖(连云港海恒生化科技有限公司,批号20170301,含量100%);5-脱氧-β-D-核糖(连云港海恒生化科技有限公司,批号20170501,含量99.6%);乙腈(色谱纯,德国 Merck 公司);超纯水(Millipore-Q 制备)。
2.1 色谱条件 Waters XBridge Amide 色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-水(70 ∶30);流速为 1 ml/min;柱温:40 ℃;进样量:100 μl;示差折光检测器温度40 ℃。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 取5-脱氧-β-D-核糖及D-核糖适量,精密称定,加流动相溶解并稀释制成每1 ml 分别含0.1 mg 的混合溶液,作为杂质贮备液;精密量取杂质贮备液2 ml 置10 ml 量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 称取样品约200 mg,精密称定,置10 ml 量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。
2.3 系统适用性试验 取上述“2.2”项下的对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液(流动相)。按照“2.1”项下的色谱条件分别进样,结果该色谱条件下的色谱峰形对称,理论塔板数为:4 955,符合2020 年版《中国药典》的相关规定。见图1。
图1 阴性样品(A)供试品(B)对照品(C)HPLC 色谱图
2.4 专属性试验 取1,2,3-三乙酰氧基-5-脱氧-β-D-核糖、D-核糖、5-脱氧-β-D-核糖适量,精密称定,用流动相溶解,分别进样,1,2,3-三乙酰氧基-5-脱氧-β-D-核糖出峰时间为2.662 min,D-核糖出峰时间为4.820 min,5-脱氧-β-D-核糖出峰时间为3.867 min,主峰与各杂质可以有效分离。
2.5 检测限与定量限 采用逐步稀释法,5-脱氧-β-D-核糖定量限、检测限浓度分别为0.005 5 mg/ml 和0.003 7 mg/ml,相当于样品中含量分别为0.027%和0.018%;D-核糖定量限、检测限浓度分别为0.006 1 mg/ml 和0.004 0 mg/ml,相当于样品中含量分别为0.031%和0.020%。5-脱氧-β-D-核糖在定量限水平精密度为 2.7%(n=6),D-核糖的精密度为 2.4%(n=6)。
2.6 线性关系试验 精密量取上述“2.2.1”项下的杂质贮备液 4、2、1.6、1 和 0.6 ml 分别置 10 ml 量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,按照“2.1”项下色谱条件进行试验,记录色谱图。以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归分析,得出线性方程。结果表明,5-脱氧-β-D-核糖在5.4~36.3 μg/ml 浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系,线性方程为Y=9.642 5 X+19.403 7(r=0.999 2,n=5)。D-核糖在 6.1~40.4 μg/ml 浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系,线性方程为Y=14.449 2 X-7.782 7(r=0.999 0,n=5)。
2.7 精密度试验 按照“2.2.1”项下方法制备对照品溶液,连续进样 6 针,5-脱氧-β-D-核糖与D-核糖峰面积 RSD 分别为3.3%和 2.4%。
2.8 重复性试验 取同一批(批号20180429)样品,按照“2.2.2”项下方法制备 6 份供试品溶液,并按“2.1”项下色谱条件进样测定,结果均未检出5-脱氧-β-D-核糖和D-核糖。
2.9 溶液稳定性试验 取对照品溶液和“2.10”项下的100%回收率1#样品溶液,在室温分别放置 0、4、8、16 和 24 h,按“2.1”项下色谱条件测定,结果表明对照溶液和样品溶液在24 h 内基本稳定,对照溶液中,5-脱氧-β-D-核糖的 RSD 为 2.5%,D-核糖的 RSD为2.1%;样品溶液中5-脱氧-β-D-核糖的RSD 为2.0%,D-核糖的RSD 为1.7%。
2.10 加样回收率试验 称取样品(批号20180429)9份,每份约200 mg,精密称定置10 ml 量瓶中,精密加入“2.2.1”项下的杂质贮备液 3、2 和 0.6 ml,用流动相稀释至刻度,摇匀,分别作为150%、100%和定量限浓度水平回收率样品溶液,每种浓度制备3 份。分别进样,计算回收率,结果表明5-脱氧-β-D-核糖及D-核糖平均回收率分别为101.0%和100.2%,RSD 分别为2.9%和3.2%。在150%、100%及定量限水平回收率均符合规定。见表1 和表2。
表1 5-脱氧-β-D-核糖加样回收率试验结果
表2 D-核糖加样回收率试验结果
2.11 样品测定 取5 批1,2,3-三乙酰氧基-5-脱氧-β-D-核糖样品,按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定,结果见表3。
表3 样品中有关物质含量测定结果
3.1 检测器选择 由于D-核糖与5-脱氧-β-D-核糖无紫外吸收,不适合使用紫外检测器方法,因此使用HPLC 示差折光检测器测定;示差折光检测器为通用型检测器,可以对两种杂质进行有效检测,故选择示差检测器为本试验色谱系统的检测器。
3.2 进样量的选择 示差折光检测器灵敏度比较低,且基线受温度、流动相组成影响较大,一般用于常量检测,较少用于痕量检测。本方法采用示差检测器检测5-脱氧-β-D-核糖与D-核糖线性浓度分别在5.4~36.3 μg/ml 和 6.1~40.4 μg/ml,经方法验证,进样量为100 μl 时,方可满足检测需求。
3.3 色谱柱的选择 本研究曾试用Waters Symmetry Shield RP-18 与Waters XBridge Amide 两种不同型号色谱柱,从分离度、峰形、响应值3 个方面考查。在Waters XBridge Amide 柱上分离度较好,峰形对称,故选用该色谱柱。
3.4 耐用性试验 对方法耐用性进行试验,通过改变流速[(1.0±0.1)ml/min]、柱温箱[(40±2)℃/min]、流动相比例(乙腈-水 72∶28 和 68∶32)等试验条件,考查色谱峰分离情况,结果各色谱峰之间分离良好。表明本试验方法的耐用性良好。