昆虫病原线虫培养及应用

黄 山，马 娟，瓮巧云#

1.河北北方学院 农林科技学院，河北张家口 075000；2.河北省农林科学院 植物保护研究所，河北保定 071000

昆虫性病原线虫（Entomopathogenic nematodes，简称EPNs）隶属于线虫门（Nematoda）、尾感器纲（Secementea）、小 杆 目（Rhabditida），是 指一类专性寄生昆虫的致病性线虫，包含斯氏线虫科Steinernematidae的斯氏线虫属Steinernema与新斯氏线虫Neosteinernema线虫和异小杆线虫科Heterorhabditidae的异小杆线虫属Heterorhabditis线虫[1]。

1 昆虫病原线虫的生活史

昆虫病原线虫常寄生于害虫的体内，全身呈半透明，细长圆锥状，中间略圆，两端稍尖，体表包裹着一层非蛋白质的弹力角质层，并分布着一些横纹。昆虫病原线虫并不是真的分节动物，它并不具备循环系统和呼吸系统，但有分泌、中枢神经控制系统、消化吸收管理系统、繁殖管理系统，而且有所谓的肌肉系统[1]。

昆虫病原线虫的生命可分成3个发展阶段，即卵、幼体和成虫发展阶段，其中幼虫一般有4个年龄范围，在经过4个蜕皮发展阶段以后，即变为成虫。在生物环境中，产生的为感染期幼虫（Infective Juveniles, IJs），这是线虫的生存史中具备入侵力量并且可独立生存于寄主体外的唯一虫态。虫态不取食，体外覆盖着经过蜕去的第二龄幼体的表皮（也称外鞘），对外界条件的耐受性较好。而在消化道中则包括与其共存的嗜线虫杆菌属Xenorhabdus和发光杆菌属Photorhabdus细胞。在昆虫病原线虫侵染期，幼虫寻找到新宿主之后，便利用宿主表面的天然开口或体壁进入成虫体腔，进行了一种全新的生活史循环。

根据昆虫病原线虫生命史的长度，又可将它们分成以下2种：长生命史型和短生命史型。长生命史型线虫通常在昆虫体内生长了2～3代，但短生命史型线虫与其不同，处于短生命史型并不是第2代，而第1代雌成虫所产生的虫卵也可以转变为侵染线虫。在生命史领域，有斯氏线虫科和异小杆线虫科的不同。斯氏线虫成虫生殖方式为两性生殖，第1代成虫分为雌雄两性。而异小杆线虫第1代成虫为雌雄同体，第2代才转变为雌雄异体线虫，具有特殊的异型生活史。

2 昆虫病原线虫的致病机理

EPNs中产生于消化管中的共生病菌，其侵入寄主机体的方式大多为利用寄主的自然通道或伤口的节距膜等，当其接触寄主害虫机体后，线虫携带的共生病菌进入寄主机体血腔生长，造成宿主机体细胞被损伤，共生菌在害虫的血腔中形成毒素和抗菌物质。通常，在48 h后，寄主即可发生败血症而死去。昆虫病原线虫与共生菌共同消耗害虫身上的营养并共同生长。当宿主体内的营养已被耗尽时，感染期幼虫爬出昆虫身体，不断寻找新宿主昆虫，并以此形成对昆虫病原线虫生长的可持续抑制。

此外，共生菌还能够形成抗生素以控制对其他杂交细菌的污染，这就为线虫的正常生长、发育和繁殖创造了理想的生存环境条件。共生菌也可以对线虫的成长供给必需的养分，并且共生菌可以形成对其他杂菌不同的抗生素，这也为线虫的成长与繁殖创造了理想的条件。

昆虫病原线虫与其共生菌间是互利互惠的伙伴关系，共生菌根本无法独立入侵害虫，只有由线虫直接将其引入；当昆虫致病线虫入侵昆虫身体血腔后，随即放出共生菌，共生菌溶解宿主细胞，并供给线虫养分，促使其不断成长。在双方共同结合的情况下，昆虫致病线虫就可以对宿主或害虫造成致命的后果[2]。

3 昆虫病原线虫的生态学特性

目前，昆虫病原线虫在生活和生产中得到了越来越广泛的应用，它的生态学研究也随之得到发展。当昆虫病原线虫离开寄主昆虫后，其在土壤中存活时间的长短与防治效果，主要取决于土壤温度、湿度、太阳辐射和天敌等环境因子与生态因子。

3.1 温度

温度是昆虫病原线虫能够正常生长发育的环境因素之一，也是其能否成功侵染寄主的关键因子。昆虫病原线虫只能在适合其品系线虫的温度范围内寄生、生存及繁殖。目前，已经有报道表明，大部分的昆虫病原线虫适宜的侵染温度是（25±1）℃，最适宜的离体培养温度为 20℃～25℃。一般情况下，0℃～40℃之间是昆虫病原线虫可以耐受的温度，当温度达15℃以上时，昆虫病原线虫就开始活动，线虫活动和侵染的适宜温度为20℃～30℃，温度达35℃～40℃时，线虫将失去活动能力，甚至全部死亡。线虫的品系不同，适宜温度也有所不同。温度过高则不利于线虫的存活；温度过低，线虫的活动能力也会有所下降。

3.2 湿度

在适宜的水分条件下，生物体才能进行一系列的日常行为，昆虫病原线虫的种类不同，对湿度的要求也不同。EPNs喜欢高湿的环境，但并非湿度越高越好，土壤间隙中存在一定的水分，能够形成一层水膜，有助于昆虫病原线虫在土壤内的移动。昆虫病原线虫一般在干燥状态下存活的时间较短。当水分条件不足时，有些线虫的身体会卷曲呈线圈状，以减少身体与空气的接触面积，达到减少水分流失的目的，身体也就逐渐进入脱水状态。

3.3 天敌和太阳辐射

已有研究表明，昆虫病原线虫的天敌能够影响其防治害虫的效果。在土壤中存在的有些生物体，如食线虫真菌、细菌、原生动物、线虫、螨类等，以及其他微小节肢动物的存在，可以影响昆虫病原线虫在土壤中的活动。

太阳辐射也对线虫有很强的杀伤力，当紫外线直接照射到线虫时，仅需要几分钟的时间线虫就会死亡。如果在湿度较高的环境下，或借助一些光保护剂（4-氨基苯甲酸等），线虫的抗辐射能力在一定程度上也能够得到增强[3-4]。

4 昆虫病原线虫的培养方式

线虫的培育方法也一直在不断地发展，目前，人们认识到的培育法主要有活体培育法、离体培育法、无菌培养法以及单菌培育法。其中单菌培养法又可分成固相和液相两类培育法。

4.1 活体培养

活体繁殖即侵染期线虫进入宿主虫体后，以宿主内的自然有机质为养分，刺激线虫的生长。目前，我国和国外进行过活体培育的昆虫中，应用最广泛的是大蜡螟（Galleria mellonella），用老熟虫卵作为新宿主，通过这个技术能够更长时间地保留线虫的高致病性。

4.2 离体培养

离体培养是一种利用人工培养基繁殖线虫的技术，主要包括无菌培育、固态培育和液态培育。

4.2.1 无菌培养基无菌敷料培养基指在人工培养基组分内添动物肝脏浸出物和牛血清等需要特殊的营养，并在无菌环境下接种的培养基。

4.2.2 固体培养线虫的固相单菌培育方法采用了无菌操纵法，将共生细菌和单菌线虫的物种注射在人工培养基上，然后再加入海绵中，以大规模培育。早期的线虫固态培育大多使用狗饲草、鸡内脏以及其余的哺乳动物内脏材料，还有豆粉、酵母膏、小麦油等，基本实现了线虫的固态顺利培育。同时还用海绵作为线虫培育的填充物，从而使线虫的固态培育顺利进入工厂化。

4.2.3 液体培养基液体培养法是指在接有共生细菌的液态培养基上接入线虫的一级种。Glaser和Stoll在早期分别用小鼠肝匀浆液和小牛肉汁少量培养线虫，结果发现动物的组织液对产量有着很大影响。

在过去的15年间，昆虫病原线虫的商业化技术工作已经得到了很大的进展。从早期通过大蜡螟体内活体培育方法实现了昆虫病原线虫的增殖与培育，至20世纪80年代，通过在鸡汁培养基的体外大量饲养线虫方法和对线虫液态培育2种技术的成功开发，逐步促使昆虫病原线虫的技术研发与商业化技术得到普及。而目前，昆虫病原线虫的规模化人工养殖方法大多通过固态培育和液态饲养技术。

5 昆虫病原线虫的应用

随着人们环保意识的增强，在注重提高农作物产量的同时，也越发重视食品安全和环境保护等方面的问题，生物防治也随之受到关注，并且在害虫综合防治中占据重要地位。生物防控的环境污染小，能够有效减少残毒遗留，可有效保护天敌，是当今有害生物防控所探讨的重点，是有害生物综合治理的重要方法之一。其中，昆虫病原线形动物门是一种新兴的生物防治技术，有着如下优势：寄主范围大，对宿主害虫有高度自主的功能，其自身繁殖速度快、对人畜、植物、有益微生物安全，无毒，在田间使用中还可以与各种杀虫剂混合应用。同时，EPNs也在许多国家已开展了广泛的应用，如韩国、日本等地区[5-6]。从1985年中国在澳大利亚引入了昆虫病原线虫的离体培植技术至今，中国已经完成制造了昆虫病原线虫中试放大制剂，并已广泛应用于各种农林业害虫防治[7]。

5.1 利用昆虫病原线虫防治异迟眼蕈蚊幼虫

钱秀娟等[8]以甘肃省分离获得的优质昆虫致病线虫Steinernema feltiae0619HT品系，以优质低毒药剂吡虫啉为基础资料，再通过药膜法的检测将吡虫啉原药单用、与昆虫致病线虫斯氏线虫Steinernema feltiae0619HT品系混合，结果证明了EPN能够与吡虫啉（用量减半）混合，用于预防韭菜异迟眼蕈蚊幼虫的危害；昆虫病原线虫的S. feltiae0619HT品种中，将1 000 IJS/mL和低用量的（3/4LC50即10 mg/L）的吡虫啉混合后，对异迟眼蕈蚊的毒性明显增强，从而能够达到对吡虫啉减量增效的作用。

赵国玉[9]测试了昆虫病原线虫对韭菜迟眼蕈蚊幼虫的防治效果，试验结果显示，对韭菜迟眼蕈蚊4龄幼虫产生最良好的侵染作用是对Heterorhabditis bacteriophoraH06、H. indicaLN2 线虫，对虫卵的侵染效果最佳的是H. indicaLN2线虫，并且，气温在25℃～30℃之间对幼虫的侵染效果最佳。

5.2 利用昆虫病原线虫防治天牛

陈贤群等[10]研究了不同剂量（250、500、1 000、2 000和4 000 IJs/mL）的2种昆虫病原线虫，即小卷蛾斯氏线虫Steinernema carpocapsae和嗜菌异小杆线虫Heterorhabditis bacteriophora对核桃云斑天牛卵和幼虫的防治效果。施用剂量为4 000 IJs/mL的小卷蛾斯氏线虫对该天牛卵的校正防治效率可达65.0%，对幼虫的最终校正防治效率达93.8%；而嗜菌异小杆线虫对该天牛卵的校正防治效率达39.5%，对该天牛卵的校正防治效率可达82.4%。由此可见，适宜剂量的昆虫病原线虫对云斑天牛幼虫的田间防控效果好于对卵的效果，可以作为云斑天牛的有效防治技术。

钱秀娟[11]以甘肃省昆虫病原线虫Steinernema feltiae0619HT和Heterorhabditis megidis0627M 这2个品系为研究对象，研究了昆虫病原线虫对蛴螬的致病力。S. feltiae0619HT品系对华北大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）致死时间较短，而H. megidis0627M 品系的累积致病力较强，通过实验室室内致病力测定昆虫病原线虫侵染蛴螬的适合剂量为3 200 IJS/ H。田间防治效果表明：试验天然草场施用S. feltiae0619HT和H.megidis0627M线虫2周后，大栗鳃金龟（Melolntha hippocastanica）虫口减退率分别为83.8%和79.5%。说明S. feltiae0619HT和H. megidis0627M线虫品系对甘肃省蛴螬具有较高的防治效果，是一种有效的生防因子。

5.3 利用昆虫病原线虫防治蛴螬

范芳芳[12]利用花盆模拟田间试验，试验结果表明：当线虫的含量达到 5 000 IJs/mL时，线虫对蛴螬的致死率最高可达73.33%，施用高效氯氟聚酯、辛硫磷对蛴螬的致死率分别可达86.67%、83.33%、63.30%，利用线虫防治蛴螬有望代替传统化学农药。

李而涛等[13]对分离到的樱桃异小杆线虫Heterorhabditis beicherriana的1个品系，将其命名为LF品系进行试验，该品系对蛴螬具有比较强的致病力。在室内试验中，剂量在200 IJs /头下，对华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita、暗黑鳃金龟H. parallela和铜绿丽金龟Anomala corpulenta幼 虫 处 理7 d后，3种幼虫1龄末期幼虫死亡率均可达70.0%以上；在室外盆栽试验中，5 000 IJs/盆剂量下处理7 d后，3种幼虫、2龄中期幼虫死亡率均达到了80.0%以上。表明樱桃异小杆线虫LF品系对华北地区蛴螬类地下害虫生防潜能巨大。

6 前景与展望

经过几十年的研究与发展，昆虫病原线虫的杀虫剂技术已经从以前的昆虫病原线虫发展为多种昆虫病原线虫来防治多种害虫，微量化学物质与线虫混合管理的结构变化使得昆虫病原线虫在害虫防治中的应用越来越成熟[14]。

与一次性使用农药相比，使用EPNs控制隐藏害虫的效果更好，EPNs可在工厂批量生产。其应用规模正在逐步扩大，引起了国内外的极大关注。大量针对共生细菌杀虫蛋白质研究的报告指出，昆虫病原线虫及其共生细菌可能成为继BT以后又一个可以创造杀虫蛋白质基因的微生物资源，而且随着该类资源的突变种类越来越丰富。因此，应做好对昆虫病原线虫与共生杀虫蛋白的应用研究，以及在未来农业害虫合成中的应用。