微卫星不稳定性，EGFR蛋白，P53蛋白的表达与大肠癌的临床病理特征关系的相关性

郝鹏岩 吴勇 刘晓梅 张镝 李文杰

【摘要】目的：探讨大肠癌中微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）状态，EGFR蛋白及P53蛋白的表达与临床病理特征的相关性。方法：应用免疫组化方法，检测90例大肠癌组织中MSI蛋白（MLH1蛋白，PMS2蛋白，MSH2蛋白，MSH6蛋白）、EGFR蛋白及P53蛋白表达状态，检测MSI基因体系及胚系突变情况，分析不同临床病理特征的关系。

结果：在90例大肠癌组织中，免疫组化检测出微卫星不稳定共16例，占比17.8%，基因检测出微卫星不稳定体系突变6例，占比6.7%，其中体系与胚系均突变1例，占比1.1%。免疫组化结果显示：腺癌伴粘液腺癌成分共15例，微卫星不稳定6例，占比40%，高于腺癌占比13.3%（P=0.014）。右半结肠癌共21例，微卫星不稳定7例，占比33.3%，高于左半结肠癌占比13.0%（P=0.033）。

免疫组化检测出EGFR阳性共49例，占比54.4%。其中，年龄大于67岁者46例，EGFR阳性30例，占比65.2%，高于年龄小于66岁者占比43.2%（P=0.036）;肿瘤最长径小于4.7cm者共42例，EGFR阳性34例，占比81%，高于肿瘤最长径大于4.7cm者占比31%（P=0.000）.

免疫组化检测出P53突变共59例，占比65.6%。其中，淋巴结无转移者55例，P53突变41例，占比74.5%，高于淋巴结有转移者占比51.4%（P=0.024）。

结论：在大肠癌组织中，微卫星不稳定性与癌症类型及部位相关，EGFR蛋白表达与患者年龄及肿瘤大小相关，P53蛋白与肿瘤淋巴结转移相关。因此，MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、EGFR、P53联合筛查可以为靶向治疗提供用药指导，可以提高患者的生存预期。

【关键词】大肠癌;微卫星不稳定;MMR;EGFR;P53

研究背景：

大肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一。随着政府对大肠癌筛查的重视，肠镜的应用，使很多大肠癌能够做到早发现，早治疗。但随着人们生活习惯的改变，发病率仍呈现上升化、年轻化趋势。目前大肠癌多采取以手术为主，放、化疗为辅的综合治疗手段。虽然部分患者可以通过免疫疗法或靶向治疗获益，但大肠癌患者的死亡率和发病率仍然呈现上升的趋势，5年生存率仅在50%左右，疾病防控形式仍然严峻。

林奇综合征是由四种错配修复基因（MLH1，MSH2， MSH6， PMS2）突变引起的，会增加患癌症的风险，尤其是结直肠癌和子宫内膜癌。错配修复基因是造成微卫星不稳定的主要因素，也就是说是由于错配修复蛋白（ Mismatch repair  MMR） 的表达缺失造成的。确认林奇综合症携带者能预防和早期发现癌症，并且对高危亲属的进行体检;可以改善疾病的预后，降低医疗成本。

表皮生长因子受体（ EGFR） 属于受体酪氨酸激酶HER/erbB。EGFR参与细胞损伤修复、介导细胞黏附、侵袭、迁移、生存、分化以及激活重要的细胞信号通路等。根据相关文献显示，EGFR 的过表达与多种实体瘤的转移和侵袭密切相关。

p53的研究较多， 是迄今发现的与人类肿瘤关系最密切最常见的突变基因。 p53 基因在大肠癌中突变率高达70 %。因此检测P53基因突变，并能改善p53 基因的功能对治疗结肠癌尤为重要。Rayburn 等 研究发现， 通过改善p53 的功能，TLR9（ tol1-1ike receptor 9） 激动剂可促进结肠癌细胞的凋亡， 增加癌细胞对放、化疗的敏感性。

本研究通过免疫组化SP方法研究MMR蛋白质的表达，EGFR蛋白及P53蛋白表达，MSI基因体系及胚系突变情况，并分析其表达情况与大肠癌临床病理特征的关系。希望可以找到该蛋白是如何影响大肠癌的发病及在不同部位大肠癌中的表达意义。

材料与方法：

研究对象：本研究得到了中美医院道德伦理委员会的批准。选取2018 年1月至2020 年12月在京东中美医院手术的大肠癌患者90 例。纳入标准： 病理诊断证实为原发性大肠癌，术前未接受任何放化疗等治疗，临床病理资料完整，均自愿参加并签署知情同意書。大肠癌患者中男性47 例，女性43 例，年龄中位数为66岁，平均肿瘤直径（4.7±1.77） cm; 肿瘤部位： 左半结肠69 例，右半结肠21 例; 临床分期： Ⅰ期18 例，Ⅱ期35 例，Ⅲ期33 例，Ⅳ期4例; 淋巴结转移35 例，组织学分化： 低分化15 例，中分化44 例，高分化31 例。腺癌伴粘液腺癌成分15例。所有患者的组织样本，均经10% 的甲醛溶液固定，制成石蜡包埋切片。

MMR基因检测：取患者癌组织（肿瘤成分在80%以上）及癌旁5cm处正常黏膜，常规切片8μm厚10张，送往北京基石医学检验实验室有限公司进行检测。检测内容：NR21、Bat26、NR27、Bat25、NR24、Mono27、Penta C、Penta D、Amelogenin 。检测方法：多重荧光PCR—毛细管电泳。检测设备：ABI 3730xl型遗传分析仪。按照NCI对肿瘤MSI的评判标准进行判读，有2个及以上改变为高度微卫星不稳定性（microsatellite instability-high，MSI-H），1 个改变为低度微卫星不稳定性（m i c ro s ate l l i teins tabi l i ty- l ow，MSI -L），无改变为微卫星稳定（microsatellite stable，MSS）。

免疫组织化学SP法检测错配修复蛋白（m i sma t c h r e p a i r p r o t e i n ，MMR）MLH1，PMS2，MSH2，MSH6表达。肿瘤旁正常组织为正常内阳性对照。MMR蛋白缺失表现为肿瘤组织核表达阴性，而肿瘤旁正常结肠黏膜上皮及淋巴细胞核阳性。当任何1 个蛋白表达缺失即定义为错配修复蛋白功能缺陷（MMR defi c i ent，dMMR）。均阳性则为错配修复蛋白功能正常（ M M R proficient，pMMR）（表1）。

免疫组织化学SP法检测EGFR蛋白表达。EGFR定位在细胞质和细胞膜。计算EGFR时均根据染色强度以及阳性细胞数，判断依据则可以将其得分作为参照。阳性细胞数评分标准： 1 分（ ≤25%） ;2 分（ 26% ～ 50%） ; 3 分（ 51% ～ 74%） ; 4 分（ ≥75%） 。染色强度评分标准： 1 分（ 淡棕色） ; 2 分（ 棕黄色） ; 3 分（ 棕褐色） 。综合评分标准： 0 ～ 1 分（ - ） ; 2 ～3 分（ + ） ; 4 ～ 5 分（ + + ） ; 6 ～ 7 分（ + + + ） ，其中+～ + + + 为阳性（表2）。

免疫组织化学SP法检测P53蛋白表达。p53蛋白表达于细胞核，肿瘤组织75%以上核弥漫强阳性或<5%染色或全阴性，则为p53突变型，5%～75%强弱不等阳性表达为p53蛋白野生型（表3）。

所有免疫组化结果均由两名主治级别以上医师分别进行判读，后采用平均数。以上所有免疫组化抗体及试剂均购自河南赛诺特生物技术有限公司，并严格按照试剂盒要求步骤进行检测。

结果：

在大肠癌肿瘤组织中MMR、EGFR、P53蛋白的表达结果显示，dMMR16例，占比17.8%，EGFR阳性49例，占比54.4%，P53阳性59例，占比65.6%。

大肠癌临床病理特征与MMR、EGFR、P53蛋白表达的关系。腺癌伴粘液腺癌成的肿瘤以及肿瘤部位与dMMR有明显关系，年龄以及肿瘤大小与EGFR蛋白表达有明显关系，肿瘤转移情况与P53蛋白表达有明显关系。具体情况见表1。

MMR基因检测结果显示，微卫星不稳定6例，占比6.7%。其中体系与胚系均突变者1例，占比1.1%，根据临床病史，其父亲也为大肠癌患者，可以明确诊断为林奇综合征。

讨论：

河北省廊坊市三河市、香河县和大厂回族自治区地理位置紧邻北京市，位于北京市东侧，俗称北三县。由于经济发展，近10年来，北三县外来人口增多，导致本地人口占比不足十分之一。往来北京市通勤的人口大约有30万左右。随着人口迁徙，生活习惯的改变，目前当地大肠癌的发病是否受到影响，目前尚未有人研究。

有的研究表明，在大肠癌的标本中，EGFR的表达占比达61%，本研究EGFR的表达占比54.4%，无明显差异。EGFR的过表达参与肿瘤细胞的转移，本研究显示在部分大肠癌患者中，随着年龄的增长，EGFR的过表达率升高，说明年龄是肿瘤转移的高风险因素。肿瘤直径越小，EGFR的过表达率越高，说明肿瘤在发生的早期阶段，转移性和侵袭性会增高。

有研究表明，在大肠癌的标本中，dMMR占比约为16%。本研究显示dMMR占比17.8%，无明显差异。在腺癌伴粘液腺癌的大肠癌标本及右半结肠癌中，dMMR的表达率明显增高。免疫组化表达出的dMMR，比基因檢测出的dMMR比例高，说明有些基因未出现突变，但蛋白质表达被沉默了。其对大肠癌的发病影响是否一致，对靶向治疗是否有影响，有待进一步研究。

本研究显示P53的突变率为65.6%，接近70%，无淋巴结转移的突变率增高，说明P53不仅在癌症的发生发展中起到关键作用，有可能在癌症的转移中也起到某些作用，有待进一步研究。

总之，MLH1，PMS2，MSH2，MSH6，EGFR 及P53蛋白的表达与大肠癌的转移、生长、侵袭都有着较大关联，因此，微卫星不稳定四项蛋白质，EGFR及P53三者的联合筛查可以为靶向治疗提供用药指导，有利于高危患者的早期判断，有利于患者预后的判断。

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