基于叶片形态特征的金秀罗香乡茶树种质资源多样性分析

檀业维，彭靖茹，温立香，黄寿辉，李 嫄，张 芬，陈家献，袁冬寅

广西壮族自治区亚热带作物研究所/广西亚热带水果加工工程技术研究中心，广西 南宁 530001

广西壮族自治区来宾市金秀瑶族自治县位于广西中部地区，年平均气温17℃。金秀瑶族自治县罗香乡、六巷乡等都分布有野生茶树，加工的红茶色泽黑润无毫[1]。罗香乡位于金秀瑶族自治县的东南部，具有“晴时早晚遍地雾，阴雨时节满山云”的气候，在罗香乡的罗运、罗丹、平竹、大新等村的原始森林内，野生茶树比比皆是。这就是堪称与“茶祖之乡”云南古茶相媲美的金秀罗香野生茶[2]。2014年黄亚辉等[3]对金秀县47份野生茶资源开展形态学研究，发现金秀茶树资源形态多样性丰富，并将金秀野生茶树分为古陈大叶种、大瑶山长叶种、共和小叶种三种类型。2016年陈莹玉等[4]采用简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）分子标记，构建了广西金秀县4 地22 份野生茶资源的分子指纹图谱，表明广西金秀县茶树品种明显的遗传多样性和地域独特性。2018年莫岚等[5]对金秀县8个野生茶树群体进行茶多酚、氨基酸和生物碱等主要生化特征分析，筛选出高茶多酚、高氨基酸和高 EGCG 等特异资源。2018年莫岚等[6]对金秀罗香乡、六巷乡、金秀镇和大樟乡共40份茶树资源的儿茶素和氨基酸组分含量进行分析，筛选出高氨基酸和高 EGCG等特异资源。目前对金秀县茶树资源的研究多从分子层面和生化层面探讨，而从形态层面深入对金秀县罗香乡茶树资源进行探讨的较少。作物形态性状变化大、复杂多样，但因简单直观，便于观察和获取，具有便利性，因此形态标记在区别不同种质资源的遗传学研究中仍被广泛应用。形态标记已经运用于甘薯[7-8]、大豆[9]、魔芋[10]和木薯[11]等遗传多样性分析，2018年陈涛林等基于叶片等形态学性状对柳州融水九万山古茶树进行了聚类分析，表明九万山古茶树多为中叶型资源[12]。本项目组采集了罗香乡现有的大部分野生茶树种质资源，基于叶片形态对其种质资源多样性进行分析，可为罗香乡茶树资源的利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

来自收集的广西壮族自治区金秀瑶族自治县罗香乡现有茶树种质资源，编号为L1 ～ L60。

1.2 试验方法

按照《茶树种质资源描述规范和数据标准》[13]测量并记录茶树的叶长、叶宽、叶片大小、叶形、叶色、叶身、叶脉对数等16个性状情况，并对结果进行赋值，具体如表1所示。

表1 茶树叶片形态标记及编码Table 1 Morphological markers and coding of tea leaf

二元性状是性状表现为两种性状的；多态性状则是表现为两种形态以上的性状。对数量性状进行分类并分别赋值1、2、3和4级；X-2s≤1级＜X-1s，X-1s≤2级＜X，X≤3级＜X+1s，X+1s≤4级＜X+2s，其中X为平均值，s为标准差。

按照《茶树种质资源数据质量控制规范》，茶树叶面积计算公式为：叶面积=叶长×叶宽×0.7；根据叶面积大小，叶片大小分为小叶（叶面积＜20.0 cm2）、中叶（20.0 cm2≤叶面积＜40.0 cm2）、大叶（40.0 cm2≤叶面积＜ 60.0 cm2）和特大叶（叶面积≥20.0 cm2）。叶片大小按照测量的叶长、叶宽测量值转化叶面积，转化为多元性状。

叶片的各形态特征测量结果利用SPSS 19.0软件进行频率分析和主成分分析等；系统聚类分析方法使用组间联接和“平方Euclidean距离”，统计量为合并进程表及相似性矩阵。

2 结果与分析

2.1 叶片形态特征

2.1.1 测量及编码

根据茶树参数的测量标准，60份茶树种质资源的16个叶片形态特征测定结果如表2所示，其指标编码后的情况如表3所示。

表2 金秀罗香乡茶树种质资源形态指标测定结果Table 2 Morphological characters of tea plant germplasm in Luoxiang

表3 金秀罗香乡茶树种质资源编码结果Table 3 Coding of tea plant germplasm in Luoxiang

2.1.2 频率分析

结果显示，60份金秀茶树种质资源的叶片大小主要以小叶和中叶为主，其中中叶占60%。叶形主要有卵圆形、椭圆形、长椭圆形、批针形，其中以长椭圆形为主，占66.7%。叶色有四种，以绿色及深绿色最多，其中深绿色占56.7%，绿色占38.3%。叶基绝大部分是楔形，占85%。叶身三种形态都有，其中以内折为主，占90%。叶尖主要有急尖、渐尖、钝尖，其中渐尖最多，占63.3%；其次是急尖，占33.3%。叶面主要是微隆起，占58.3%；其次是叶面平，占33.3%。叶缘主要是以平为主，占60.0%；其次是微波，占33.3%。叶背均没有茸毛。叶质硬，占71.7%。叶齿锐度是中，占45%；其次叶齿锐度是钝，占30%；叶齿锐度是锐的占25%。叶齿密度主要是中（2.5个/cm≤密度＜4个/cm）和密（密度≥4个/cm），其中密的占95.5%。叶齿深度浅、中、深都有；其中以中为主，占45.0%；其次是浅，占41.7%。

2.1.3 主成分分析

由于茶叶叶背茸毛都无，对其余的15个性状开展主成分分析，其解释的总方差如表4所示。

表4 15个叶片形态学特征解释的总方差Table 4 Total variance of 15 leaf morphological characteristics

从表4可看出，有6个成分其特征根大于1，其中叶形特征根为3.336，解释了总变量的22.24%；叶色特征根为2.042，解释了总变量的13.61%；叶基特征根为1.631，解释了总变量的10.874%；叶身特征根为1.602，解释了总变量的10.680%；叶尖特征根为1.228，解释了总变量的8.186%；叶面特征根为1.055，解释了总变量的7.03%。这6个主成分解释了15个总变量的72.621%。可见，在对茶树的叶片进行观察时应着重对这6个成分进行分析，从而快速区别茶树种质。

2.2 聚类分析结果

由于叶背无差异性，利用SPSS的系统聚类分析方法对除了叶背之外的特征进行聚类分析，方法使用组间联接和“平方Euclidean距离”，统计量为合并进程表及相似性矩阵，依据叶片形态特征获得金秀茶树种质资源使用平均联接（组间）的分类树状图，如图1所示。

从图1中可看出，在平方Euclidean距离为25处，60份茶树资源主要分为2大类。其中第一大类只含有1份种质L38，L38叶片的主要特征是小叶，叶形卵形，叶色绿色，叶基近圆形，叶身内折，叶尖渐尖，叶面与叶缘平，叶背茸毛无，叶质软，叶齿锐度中，叶齿深度中，叶齿密度密。L38与其它种质的鉴别特征是叶形卵形，叶基近圆形。

图1 金秀茶树叶片形态特征标记聚类分析结果Figure 1 Cluster analysis of leaf morphological characteristics of Jinxiucha

第二大类包括59份种质，在平方Euclidean距离为16处可分为2类，其中一类只包含L20和L60。这两份种质与其它种质的鉴别特征是叶色为黄绿色。两者在叶片大小、叶齿等方面有差别。L20是小叶，叶齿锐度中，叶齿深度中；而L60是中叶种，叶齿锐度锐，叶齿深度深。其余的57个茶叶资源可分为两个亚类。第一亚类包含32个茶树资源，与其它种质的鉴别特征是叶面隆起性，叶身内折。在平方Euclidean距离为10处可分为2个亚亚类，其中第一个亚亚类有L24、L51、L31、L48、L3、L52、L59、L29、L37、L46、L43、L14、L4、L10、L21、L23、L22、L35和L45共19份种质；这些种质的共同特征是叶片大小为中叶，而叶型、叶质等都有差异。第二个亚亚类有L9、L44、L15、L6、L25、L54、L8、L13、L5、L30、L55、L41 和L40共13份种质；这些种质的共同特征是叶齿密度密。第二亚类包含25个资源，与其它种质的鉴别特征是叶尖。在平方Euclidean距离为10处也可分为4个亚亚类，其中第一个亚亚类有L33和 L39。L33是小叶，稍背卷，叶缘微波，叶质硬，叶齿深度中；L39是小叶种，叶身平，叶缘波，叶质中，叶齿深度浅；其余的形态特征相同。第二个亚亚类有L47、L50、L57、L53、L36、L42、L11、L12、L16、L17、L27、L56、L32、L34、L49、L18、L26、L1、L2、L58和L28共21份种质，这些种质的共同点是叶齿深度深。第三个亚亚类只包含L19，叶尖显著钝尖。第四个亚亚类只包含L7，叶形最显著的特征是披针形。

通过聚类分析结果，我们可以简单明了地了解金秀罗香乡茶树种质资源叶片形态特征的多样性特点，叶形、叶色、叶质等相关叶片性状是茶树品种适制性的重要参考指标[12]。通过本研究对叶片形态性状的分析，发现金秀县罗香乡茶树资源叶片形态性状变异明显，变异范围大，表现出丰富的遗传多样性，其中尤以叶形、叶色等决定茶树适制性的重要指标变异最为丰富，说明在金秀县罗香乡茶树资源中进行优异资源的筛选和品种选育是可行的。如果我们需要针对罗香乡的茶树种质资源筛选组建种质资源圃，或者开展选育种工作，那么可以从聚类分析树状图的各分枝选取一种资源进行即可，这样可以提高种质资源筛选的效率，而且保证叶片形态特征的全面性。

3 讨论

表型性状是基因的遗传变异与环境相互作用的结果，表型特征的变异能反映出基因型和群体或生态型的变异。而形态标记具有直观性，能快速区分出不同的表型个体，农艺性状的鉴定和描述仍然是种质资源研究的最基本的方法和途径[14]。按照茶树的叶型来分类，茶树可以分为特大叶型、大叶型、中叶型和小叶型。通过对金秀罗香乡茶树的叶形进行分类，可知其主要是中、小叶种，这与黄亚辉的调查基本一致[1]。通过SPSS 19.0统计软件对罗香乡茶树的15个叶片形态性状进行主成分分析，可知叶形、叶色、叶基、叶身、叶尖和叶面这6个变量可解释总变量的72.621%，其余的9个变量才解释27.379%，因此这6个变量可以作为基于茶树叶片进行分类鉴定和筛选的主要指标。

对60份罗香乡茶树资源进一步进行聚类分析，结果表明罗香乡茶树种质资源间变异明显，变异范围大，表现出丰富的遗传多样性，其中尤以叶形、叶色等决定茶树适制性的重要指标变异最为丰富，利用叶片形态标记对金秀罗香乡茶树资源进行初步分类鉴定和筛选是可行的。陈莹玉等利用RAPD分子标记对金秀县的部分野生茶树资源开展遗传多态性研究，表明其与广东、福建的茶树遗传距离较远[4]，这与本试验结果罗香乡茶树种质资源间变异明显、变异范围大相符；莫岚等通过对金秀野生茶树的生化成分分析结果表明，金秀野生茶树群体资源的生化成分多样性丰富，变异范围大，资源类型丰富[5-6]，与本试验叶形、叶色和叶质等决定茶树适制性的重要指标变异丰富的结果相符，表明金秀野生茶具有较高的利用价值。黄亚辉已对罗香乡罗运村的白牛茶生化成分及叶片主要特征开展了相关研究[15]，但是在罗香乡其他野生茶树资源的研究方面还很匮乏。本研究通过对罗香乡部分茶树叶片的形态特性进行聚类，开展分类鉴定，为今后对罗香乡的茶树种质资源的开发利用提供理论依据。

茶树的叶型是我们快速进行分类及育种的重要依据，但是由于茶树的叶片特征常互有雷同，单纯叶片特征只能做到对资源进行初步筛选归类，很难对其进行彻底分析。若要全面准确地分析资源特性，需要结合分子标记、生化成分等分析，从多角度作全面的研究。