蒙药植物耧斗菜总生物碱的提取与鉴定

宝彩虹，敖恩宝力格

（内蒙古师范大学 生命科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特 010022）

耧斗菜（Aquilegia viridifloraPall）为毛茛科耧斗菜属植物，生长于海拔200～2 000 m 的山地或潮湿草地。在我国主要分布于华北、东北及陕西、宁夏、甘肃、内蒙古和青海等地［1］。耧斗菜全草入药，中药里主要作用为调经止血、清热解毒，用于治疗月经不调、功能性子宫出血、痢疾、腹痛等［2］；作蒙药用的时候能调经、治伤、燥“协日乌素”、止痛，主治妇科疾病、死胎、胎衣不下、骨折等［3］。耧斗菜属植物主要有效成分为生物碱类化合物，有木兰花碱、紫堇块茎碱及黄连碱等［4］。耧斗菜生物碱具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用［5-6］。本研究提取耧斗菜的总生物碱，并对其进行定性检测与结构鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器设备

耧斗菜采摘于内蒙古自治区呼和浩特市大青山小井沟（111°50'34″E，40°58'34″N）。采摘全草后清洗晾干，用植物组织粉碎机破碎，过100 目的筛子，用PEP 膜密封包装后低温保存。

盐酸小檗碱标准品购于中国生物检定所；碘化泌钾试剂、改良碘化泌钾试剂、硅钨酸试剂、Frobde 试剂、溴甲酚绿、碘化泌钾、硅钨酸、钼酸铵、溴甲酚绿、冰乙酸、浓硫酸、乙醇、乙酸乙酯、浓盐酸、三氯甲烷等试剂均购于南京建成生物有限公司。主要仪器设备有TQ0804 CG-MS（岛津有限责任公司）、超声波破碎器（上海冠特超声仪器有限公司）、UV-2000 紫外可见分光光度计（上海美析仪器有限公司）、旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）等。

1.2 标准曲线的制作

称取5.0 mg 盐酸小檗碱标准品，用甲醇定容至50 mL 得到原溶液，分别吸取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、7 mL、9mL 原溶液于试管中，分别用甲醇稀释至10.0 mL，以甲醇为空白对照测定408 nm 处的吸光值，以盐酸小檗碱浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。

1.3 总生物碱的提取方法

准确称取耧斗菜干粉100 g 浸泡在2 500 mL 80% 的乙醇中，浸提24 h 后超声波提取2 h，振幅为80 Hz，脉冲为20 s。过滤收集滤液，进行旋转蒸发，得乙醇浸膏，用10 mL 1% 的盐酸进行溶解后再过滤，收集滤液，用浓氨水调pH 至9～10，用3 倍体积的氯仿进行3 次萃取，合并氯仿层，旋转蒸发，用10 mL 的乙酸乙酯溶解，测定410 nm 处的吸光度，代入回归方程，计算总生物碱含量。

1.4 生物碱的定性检测方法

取4 支试管，加入耧斗菜乙醇提取液各3 mL，依次滴加改良碘化铋钾试剂、硅钨酸试剂、溴甲酚绿试剂和Frobde 试剂各6 mL，摇匀静置观察，同时做3 个平行样。

1.5 生物碱的结构鉴定方法

采用CG-MS 对耧斗菜生物碱进行结构鉴定［7-8］。GC-MS 检测条件为：进样口温度270 ℃；分流比为50∶1；初始温度120 ℃保留2 min，以20 ℃/min 升温至280 ℃保持15 min；柱流量为1.8 mL/min 不分流方式进样；离子源温度为230 ℃；传输线温度为280 ℃；EI 源电离方式；电子能量为70 eV；电子倍增气电压为1800 V。

2 结果

2.1 生物碱的含量及定性实验结果

以盐酸小檗碱浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线（如图1），得到回归方程：y=9.932 8x-0.005 9，R2=0.998 8。根据回归方程计算出总生物碱浓度为0.124 mg/mL，1 g 耧斗菜干粉中的总生物碱含量为0.155 mg，提取率为0.016%。

图1 盐酸小檗碱吸光度标准曲线Fig.1 Absorbance standard curve of berberine hydrochloride

生物碱定性实验结果如表1 所示。从实验结果可知，耧斗菜提取液对生物碱定性试剂均有沉淀反应。因此，可以确定耧斗菜乙醇提取液含有生物碱类化合物。

表1 耧斗菜总生物碱提取液的定性实验结果Tab.1 Qualitative testing results of alkaloid extraction liquid

2.2 生物碱的结构鉴定结果

通过CG-MS 鉴定出2 种希夫碱类化合物，均首次从耧斗菜中发现。分别为酰腙类希夫碱2，6-二甲氧基苯甲醛氨甲酰腙（化学结构如图2 所示）和酰肼类希夫碱2-（3-对氯苯氧）N-（2，4-二甲氧基苄叉）乙酰肼（化学结构如图3 所示）。

图2 2，6-二甲氧基苯甲醛氨甲酰腙Fig.2 2，6-Dimethoxybenzaldehyde carbamoylhydrazone

图3 2-（3-对氯苯氧）-N'-（2，4-二甲氧基苄叉）乙酰肼Fig.3 2-（3-Chlorophenoxy）-N'-（2，4-dimethoxybenzylidene）acethydrazide

3 结论

在酸性条件下生物碱会解离成为离子，与生物碱沉淀剂发生反应产生沉淀，生成复盐或络盐。沉淀反应可适用于鉴别生物碱。因生物碱对各种生物碱沉淀剂的灵敏度不一样，每种生物碱的鉴别都需要3 种或3 种以上的沉淀剂［9］。本研究发现耧斗菜总生物碱提取液对4 种生物碱定性试剂均有阳性反应，可以确定耧斗菜乙醇提取液含有生物碱类化合物。本实验条件下，耧斗菜生物碱含量为0.155 mg/g，提取率为0.016%。通过CG-MS 首次鉴定出两种希夫碱类化合物，分别是酰腙类希夫碱2，6-二甲氧基苯甲醛氨甲酰腙和酰肼类希夫碱2-（3-对氯苯氧）N-（2，4-二甲氧基苄叉）乙酰肼。根据相关报道发现，从耧斗菜提取分离得到的两种希夫碱都具有良好的生物活性［4，6］。席夫碱及其配合物具有抑菌、杀菌、抗病毒、抗肿瘤、消除自由基等独特药用价值［10-12］，其中很多酰腙类希夫碱具有很好的生物活性，在医药研发领域有着潜在应用性能［10］。上述实验结果为耧斗菜有效成分的研究及开发利用提供了实验数据。