黄芩素介导PI3K/Akt信号通路对高糖诱导HK-2细胞氧化应激和炎症反应的影响研究

杨 柳，张欣雅，王 静，王 怡，程汝阳，李晨响，李 爽，赵世超，李建民

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

随着人们饮食、运动等生活习惯的改变以及社会人口结构的变化，糖尿病的发病率逐渐升高。糖尿病肾病(DN)作为糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一，已成为终末期肾脏病(ESRD)的首位病因，其发病率亦呈上升趋势[1]。近年来越来越多的学者发现，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(BPI3K/Akt)信号通路与糖尿病肾病患者因长期高血糖引起促炎因子和氧化应激产物增加而引起的肾小管上皮细胞损伤有关[2-3]。目前研究认为黄芩素具有抗炎、抗变态反应、抗氧化应激、抗肿瘤、抗血栓形成和保护肝脏、心脑血管、神经元等多种生物学作用[4]，对糖尿病肾病有一定的防治作用[5]。因此，本课题以体外培养人近端肾小管上皮细胞(HK-2)为研究对象，探讨黄芩素是否基于PI3K/Akt信号通路对糖尿病肾病发挥治疗作用，为其临床应用提供理论基础和实验依据。

1 实验材料与方法

1.1细胞株 HK-2细胞株购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

1.2实验药品和试剂 黄芩素(成都曼思特生物，批号：DH0093，纯度≥90%)；高糖：分析纯葡萄糖粉溶于DMEM培养基；DMEM低糖培养基(Hyclone，生产批号：NZM1301)，胎牛血清(Hyclone，生产批号：NYB0614)，胰酶(Hyclone，生产批号：021005)，四甲基噻唑蓝(MTT，Sigma公司，生产批号：021005)，二甲基亚砜(DMSO，天津市富宇精细化工有限公司，生产批号：20130716)，活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，生产批号分别为：S0033，20151208)，β-αctin抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司，生产批号：16A00205)，磷酸化磷酸肌醇3-激酶(p-PI3K)抗体、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗体、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抗体(博奥森生物有限公司，生产批号分别为：AD06235847E，BST10C17B，GR251111-2)，二抗羊抗小鼠、二抗羊抗兔(博士德生物有限公司，生产批号：BST10101A，BST10C17B)，SGExcel UltraSYBR Mixture(With ROX)(生工生物有限公司，生产批号：B532956)。

1.3实验仪器 CO2培养箱(HF90型，上海智城分析仪器公司)，倒置显微镜(IX-71-21PH型，日本Olympus)，实时荧光定量PCR(M×3000P型，美国Agilent Stratagene公司)，全自动生化仪(MS-500A型，四川美生科技有限公司)，一体式微型化学发光成像仪(Smart chemi Ⅱ型，北京赛智创业科技公司)，酶标仪(MK3型，上海热电仪器有限公司)。

1.4实验方法 显微镜下观察HK-2细胞密度达80%以上时，将每孔1×104个细胞接种于96孔板中，依据预实验结果以及文献[6]作为参考，选取1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L黄芩素和4×10-2mol/L浓度高糖用于后续的实验。实验分为5组：正常组只加入DMEM低糖培养基培养48 h；高糖模型组在DMEM低糖培养基中加入4×10-2mol/L浓度高糖培养48 h；黄芩素低、中、高剂量组先分别加入1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L黄芩素培养24 h后，再加入4×10-2mol/L浓度高糖继续培养24 h。

1.5检测指标及方法

1.5.1细胞存活率检测 取一定量各组细胞，加入20 μL MTT溶液培养4 h，弃掉上清液，再加入150 μL DMSO，放于摇床上震荡使结晶溶解，于570 nm处测定吸光度OD值，每组设置6个复孔，每次2块板，重复6次。

1.5.2细胞中ROS及MDA含量检测 取一定量各组细胞，按照试剂盒说明书分别检测ROS及MDA含量，以上实验重复6次。

1.5.3细胞中TNF-α mRNA表达检测 取一定量各组细胞，分别加入1 mL RNA裂解液、0.2 mL氯仿，离心，取上清液，加入0.5 mL异丙醇，离心，将沉淀加入DEPC水溶解，放入核酸浓度自动测定仪中检测RNA浓度。然后按照RT-PCR试剂盒说明进行操作，将RNA反转录为cDNA，以其模板进行PCR反应。引物序列：GAPDH上游为5’-GGTGGAGCCAAAAGGGTCAT-3’，下游为5’-CGTGGTTCACACCCATCACA-3’，退火温度60 ℃，产物大小200 bp；TNF-α 上游为5’-CTGCCCCGACTACGTGCTCCTCA-3’，下游为5’-AGTTGGTCCCCCTTCTCC-3’，退火温度55 ℃，产物大小291 bp。PCR体系：10×PCR buffer 2.0 μL；25 mmol/L MgCl 2 2.0 μL；10 mmol/L dNTP mix 0.4 μL；cDNA 1.0 μL；上下游引物各0.2 μL；Taq酶0.1 μL；双蒸水14.1 μL；总体系共20 μL。反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，35个循环。最后，将其放入实时定量PCR仪中进行检测，测灰度值，重复6次，结果以2-ΔΔCt值表示。

1.5.4细胞中p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表达检测 取一定量各组细胞，分别加入RIPA裂解液提取蛋白(加入1%蛋白酶抑制剂)，BCA试剂盒测蛋白浓度，提取的蛋白加入4×loading buffer，在100 ℃、10 min条件下发生变性，各取10 μL上样，于聚丙烯酰胺凝胶上分离(100 V浓缩胶，120 V分离胶)并转到膜上(10 V，30 min)，5%的脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗(1∶300)，4 ℃过夜，TBST洗膜3次。次日加入二抗(1∶10 000)孵育2 h，TBST洗膜3次，取出膜，加入发光液于凝胶成像系统成像，测灰度值，实验重复6次。

2 结 果

2.1各组HK-2细胞存活率比较 正常组、高糖模型组及黄芩素低、中、高剂量组的HK-2细胞存活率OD值分别为0.538±0.053，0.304±0.026，0.399±0.042，0.451±0.041，0.493±0.073，高糖模型组明显低于正常组(P<0.05)，黄芩素各组均明显高于高糖模型组(P均<0.05)，且呈浓度依赖性增高，各组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。

2.2各组HK-2细胞中ROS和MDA含量比较 高糖模型组HK-2细胞中ROS和MDA含量均明显高于正常组(P均<0.05)；黄芩素各组HK-2细胞中ROS和MDA含量均明显低于高糖模型组(P均<0.05)，且呈浓度依赖性降低，各组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 各组HK-2细胞中ROS和MDA含量比较

2.3各组HK-2细胞中TNF-α mRNA及p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表达量比较 高糖模型组HK-2细胞中TNF-α mRNA及p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表达量均明显高于正常组(P均<0.05)；黄芩素各组HK-2细胞中TNF-α mRNA及p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表达量均明显低于高糖模型组(P均<0.05)，且呈浓度依赖性降低，各组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图1及表2。

图1 各组HK-2细胞中p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表达情况

表2 各组HK-2细胞中TNF-α mRNA及p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表达量比较

3 讨 论

糖尿病肾病的发病机制十分复杂，目前普遍认为其与代谢紊乱、血流动力学异常、氧化应激、炎症反应和遗传等多个方面的因素相关[7-8]。在高糖状态下，体内可通过多种途径发生氧化应激，可产生大量的氧自由基，这些氧自由基可使肾脏的脂质过氧化物MDA含量升高，可直接或间接导致肾脏损伤[9]。本实验结果显示，模型组HK-2细胞凋亡率和细胞中ROS、MDA含量明显升高，证实高糖刺激可导致氧化应激反应，促进HK-2细胞凋亡。

近年来研究发现，ROS也可作为第二信使激活PI3K/Akt信号通路，诱发糖尿病肾病患者肾脏损伤[10]。此外，炎症反应一直是糖尿病肾病患者肾脏损伤的一个重要原因，而炎症因子分泌失调与PI3K/Akt信号通路可能也存在一定的联系[11]。Zhang等[12]和Ma等[13]研究报道，糖尿病肾病患者PI3K/Akt通路被磷酸化，伴随促炎症因子(TNF-α、IL-1、IL-6) 的分泌增多，表明炎症因子的分泌与释放可能与PI3K/Akt存在某种潜在联系。本实验结果显示，模型组HK-2细胞中TNF-α mRNA及p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表达量均较正常组明显增高，证实高糖刺激可激活PI3K/Akt通路，使炎症因子TNF-α分泌增加。

黄芩素属于黄酮类化合物，存在于黄芩、杜仲等中药中。黄芩素具有多种药理活性，可通过抗氧化应激、抗炎症反应、抗凋亡等多种机制对机体产生保护作用[14-15]。动物实验研究表明，黄芩素对糖尿病肾病有一定的防治作用，其可能通过清除体内的自由基和抑制肾脏内炎症介质表达，进而减轻肾脏损伤，保护肾脏[16]。本实验结果显示，黄芩素各组HK-2细胞凋亡率，细胞中ROS、MDA含量及TNF-α mRNA和p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表达量均较模型组明显降低，提示黄芩素不仅可抑制高糖诱导的氧化应激反应，而且可通过抑制PI3K/Akt信号通路活化来减少炎症因子产生，从而有效保护肾小管上皮细胞，为黄芩素用于糖尿病肾病的治疗提供了一定理论支持。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。