菲牛蛭粗提物冻干粉保护剂的优化

张 涛，于 翔，龚 元

(辽宁省淡水水产科学研究院，辽宁 辽阳 111000)

目前，国内外关于菲牛蛭素的报道较多。在抗凝血方面，黄爱民等[1]从广西菲牛蛭消化液中分离、提取出两种特异性凝血酶抑制剂——菲牛蛭素A和菲牛蛭素B，对凝血因子具有抑制作用。汪文茉等[2]在研究中也发现，菲牛蛭干品(全体)、头部(活体)及活体(全体)的抗凝血酶的比活均高于日本医蛭，且其头部抗凝血酶比活最高。抗血栓方面，吴军志和于立华[3]采用大鼠静脉血栓模型，研究菲牛蛭制品的抗血栓与溶栓作用，结果表明，宽体金线蛭冻干粉<欧洲医蛭冻干粉<日本医蛭冻干粉<菲牛蛭冻干粉，菲牛蛭头部冻干粉的溶栓效果更好。黎渊弘等[4]用广西菲牛蛭提取物对家兔动脉血栓、大鼠静脉及体外血栓进行抗血栓研究，结果表明，家兔注射菲牛蛭提取物后抗血栓效果较好，与注射前相比有显著差异。而关于菲牛蛭素结构方面，Steiner[5]从菲牛蛭中提取、分离出具有抗凝活性的水蛭素，并阐述了其一级结构，命名为Hm1和Hm2。Scacheri[6]从菲牛蛭中分离出水蛭素的变异体，与水蛭素HV-1的基本结构有大约70%的系列同源性，并且具有较强的抗凝活性[7]。谭恩光和刘秀平[8]报道了广东菲牛蛭素的基因序列特征，其多肽链上的半胱氨酸将形成3对二硫键对分子构型起到稳定作用，其多肽链上的酸性谷氨酸和天冬氨酸末端片段与凝血酶识别部位结合是发挥抗凝活性的关键，这与张彬[9]报道的水蛭素结构相类似。上述报道表明，菲牛蛭素是一种多肽类蛋白物质，具有较好的抗凝血、抗血栓等作用，而如何保持其结构稳定性和抗凝活性是菲牛蛭素提取工艺的重要一环。笔者通过冷冻干燥方法，设计不同保护剂配方的正交试验，从而筛选出对菲牛蛭粗提物保存较好的试验配方，为后期菲牛蛭素的进一步分离纯化和制剂学研究提供了一定的科学数据。

1 材料和方法

1.1 材料

菲牛蛭健康无病，由湖北省荆州市民康生物技术公司提供。

海藻糖、PEG2000和甘露醇来源、性状等见表1。

表1 试验药物

1.2 方法

1.2.1 菲牛蛭粗提物的提取

通过盐浸提法[10]提取菲牛蛭粗提物。将菲牛蛭活体分别称重、剪碎、匀浆，获得匀浆液；再分别用菲牛蛭体质量4倍的生理盐水稀释匀浆液，室温(23±2) ℃下不断搅拌20 min，搅拌后用质量浓度10%的三氯乙酸溶液调整pH值至2.5，65 ℃水浴15 min，其间适当搅拌；水浴后4 ℃10000r/min离心10 min，收集上清液，上清液用1 mol/L的NaOH溶液调整pH值至7.0，而后4 ℃10000r/min离心10 min，收集上清液即为菲牛蛭粗提物。

1.2.2 菲牛蛭粗提物冻干试验分组

试验设置海藻糖、PEG2000和甘露醇3个变量因素，采用3因素3水平，即L9(34)正交试验法优选菲牛蛭粗提物冻干保护剂最佳配比浓度，每组试验设定3个平行组。

取菲牛蛭粗提物水溶液415 mL，分装到50 mL烧杯中，每个烧杯分装45 mL粗提物水溶液，共9个烧杯。9个烧杯标记为1～9组，根据表2和表3加入不同质量的海藻糖、PEG2000和甘露醇，玻璃棒搅拌均匀。然后将每组搅拌好的菲牛蛭粗提物水溶液分装到对应标记的西林瓶中，每个西林瓶装5 mL粗提物水溶液， 9组共计81个西林瓶。再将全部的西林瓶放到-20 ℃冰箱，24 h后移到-80 ℃冰箱，再过24 h后用FD5505冷冻干燥机冻干至水分基本消失。

表2 因素水平的质量分数 单位：%

表3 正交试验表

1.2.3 不同条件下试验组菲牛蛭粗提物抗凝活性测定

菲牛蛭粗提物抗凝活性采用凝血酶直接滴定法测定[11-12]，分别测定粗提物冻干粉24 h内抗凝活性，(-18±2) ℃条件下粗提物冻干粉15 d后抗凝活性和(27±3) ℃条件下粗提物冻干粉15 d后抗凝活性；西林瓶中冻干粉用5 mL蒸馏水复溶，每个条件下每组设置3个平行。

1.3 数据的统计和分析

根据试验结果记录菲牛蛭粗提物冻干粉抗凝活性，试验数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示，并进行单因素和多因素的方差分析，显著水平为P<0.05；并采用层次分析法统计正交试验结果[13]。

2 结果和分析

菲牛蛭粗提物冻干粉各条件下的正交试验、方差分析及权重分析结果见表4～表8。从表4可知，粗提物冻干粉的保存活性总体趋势：粗提物冻干粉24 h内平均抗凝活性>(-18±2) ℃条件下粗提物冻干粉15 d后平均抗凝活性>(27±3)℃条件下粗提物冻干粉15 d后平均抗凝活性。其中，第1、4、7组粗提物冻干粉保存活性在不同条件下没有显著性差异(P>0.05)，其余各组保存活性在不同条件下都有显著性差异(P<0.05)。

由正交试验结果(见表4)可知，以不同条件下粗提物冻干粉的保存活性为指标，极差R值大小显示各因素对粗提物冻干粉的保存活性作用均为B>C>A，A因素R值<空列组R值，由此可知A因素并不是影响冻干粉活性的主要因素；由权重分析结果(见表8)可知，各因素对粗提物冻干粉的保存活性作用为B>C>A；因此由正交试验和权重分析综合结果分析，3种赋形剂对粗提物冻干粉活性影响大小依次为PEG2000>甘露醇>海藻糖。方差分析结果(见表5～表7)显示各因素对粗提物冻干粉的保存活性无显著差异(P>0.05)；由正交试验结果(见表4)和权重分析结果(见表8)可知，以粗提物冻干粉24 h内平均抗凝活性为考察指标，3种赋形剂最佳配方为A3B3C1；以(-18±2) ℃条件下粗提物冻干粉15 d后平均抗凝活性和(27±3) ℃条件下粗提物冻干粉15 d后平均抗凝活性为考察指标，3种赋形剂最佳配方为A2B3C1。

表4 菲牛蛭粗提物冻干粉保存试验测定结果

表5 粗提物冻干粉24 h内平均抗凝活性方差分析结果

表6 (-18±2) ℃条件下粗提物冻干粉15 d后平均抗凝活性方差分析结果

表7 (27±3) ℃条件下粗提物冻干粉15 d后平均抗凝活性方差分析结果

3 讨论

目前，国内外关于菲牛蛭素如何在提取纯化后较好地保持其抗凝活性的报道很少，而本试验采用冷冻干燥的方法保存菲牛蛭素，主要有以下几方面原因[14]。1)菲牛蛭素是一种多肽类蛋白物质，对温度比较敏感，一旦发生蛋白降解，则易失去抗凝活性；而在低温干燥条件下，菲牛蛭素受热易变性成分损失很少。2)菲牛蛭素多肽链上二硫键易被氧化而失去抗凝活性；但在真空干燥条件下，环境的氧气极少，菲牛蛭素上易被氧化的物质可以得到保护。3)冷冻干燥法可以除去菲牛蛭粗提物水溶液中95%～99%的水分，并保持菲牛蛭素结构的稳定性，从而便于其运输和长期保存。

同时，为防止冻干过程中菲牛蛭素的变性或结构的破坏，本试验选取了海藻糖、PEG2000和甘露醇作为菲牛蛭素冻干赋形剂，其主要依据有以下几点[13]。1)菲牛蛭素多肽链上二硫键易被还原而失去抗凝活性，而海藻糖属于非还原二糖，不会与冻干品发生还原性Mailard反应；同时，海藻糖作为二糖能在冻结过程中起到低温保护剂的作用，又能在干燥脱水过程中起到脱水保护剂的作用。2)PEG2000是一种聚合物保护剂，在冷冻干燥过程中，其优先析出，具有一定的表面活性，并在蛋白质分子之间产生“位阻”作用，防止菲牛蛭素蛋白降解变性；同时，PEG2000能提高菲牛蛭粗提物水溶液黏度，提高玻璃化转变温度，抑制小分子赋形剂海藻糖的结晶和pH值的降低。在生物制品冷冻干燥过程中，PEG2000既起着低温保护剂作用，又起着脱水保护剂作用。3)菲牛蛭素作为多肽类蛋白物质，慢速冻结是有利的，而甘露醇作为填充剂，在慢速冻结过程中会结晶，从而为菲牛蛭素活性组分提供结构支撑，并且不会与活性组分发生反应。

综合上述试验结果和几方面因素分析可知，菲牛蛭粗提物冻干粉抗凝活性总体趋势变化与时间和温度有一定关系，时间越长，温度越高，抗凝活性越低，这说明3种赋形剂对粗提物冻干粉活性影响随着时间的增长和温度的升高会逐渐降低，从而影响到菲牛蛭素结构的稳定性。由表4～表8可知， 3种赋形剂对粗提物冻干粉活性影响大小依次为PEG2000>甘露醇>海藻糖，各赋形剂差异虽不显著，但海藻糖并不是起主要作用的赋形剂，这说明聚合物类的赋形剂保护功能强于低聚糖及无醇类赋形剂。上述3种赋形剂的正交试验结果表明，当以粗提物冻干粉24 h内平均抗凝活性为考察指标时，3种赋形剂最佳配方为A3B3C1；以(-18±2) ℃条件下粗提物冻干粉15 d后平均抗凝活性和(27±3) ℃条件下粗提物冻干粉15 d后平均抗凝活性为考察指标时，3种赋形剂最佳配方为A2B3C1。