利用生防菌防治棉花黄萎病效果的制约因素

刘海洋，王 伟，张仁福，温切木·阿布列孜，姚 举

(1.新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091； 2. 阿勒泰市菜篮子工程办公室, 新疆阿勒泰 836500)

0 引 言

【研究意义】2019年新疆棉花种植面积占全国76.1%，产量占全国84.9%，棉花黄萎病发生也日渐严重[1,2]。生产上缺乏抗病种质资源且抗性易丢失[3]，利用环境友好的生物技术对棉花黄萎病进行防治优势凸显。【前人研究进展】土壤中的大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)的微菌核是棉花黄萎病的主要侵染源，微菌核数量与黄萎病的发生程度显著正相关[4]，微菌核抗逆性强[5]，降低土壤中的微菌核数量是防控棉花黄萎病的前提。LóPezescudero等[6]利用Diplotaxisvirgata,Lavandulastoechas和Thymusmastichina制成的有机改良剂显著降低了大丽轮枝菌产微菌核的能力，降低了该病的发生程度。吴蔼民等[7]利用内生菌拮抗菌73 a对棉苗蘸根处理后移栽入人工病田，后期调查发现内生菌73 a对棉花黄萎病具有良好的防治效果且还有一定的促进作用；林玲等[8]同样发现，生防内生细菌Jaascd的发酵液在棉苗移栽前喷施和灌根都能有效防治棉花黄萎病。石磊等[9]利用滴灌设施滴施枯草芽孢杆菌可湿性粉剂、哈茨木霉菌剂、中农绿康等生物药剂对棉花黄萎病进行了防治，发现3种生物药剂均对黄萎病发病具有明显的防治效果。【本研究切入点】新疆南疆生产上利用不同生防菌剂防治棉花黄萎病时发现存在防效不稳定、效果不佳的问题。由于生防菌与土壤中土著微生物存在竞争，生防菌与作物根部的亲和能力以及其它非生物因子同样是限制生防菌剂防治能力的重要原因[10]。生防菌(菌剂)的施用方式、施用时间等也是影响生防菌防治效果的重要因素。【拟解决的关键问题】以库尔勒棉田利用生防菌防治棉花黄萎病为例，从土壤中病原菌数量、滴施时间、生防菌定植、抑菌能力等方面分析生防菌防治棉花黄萎病过程中的主要制约因素，为棉花黄萎病的生物防治提供支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试品种

感病品种：军棉1号、新陆中36号；耐病品种：中棉所49、中植棉2号，均由新疆农业科学院植物保护研究所提供。

1.1.2 供试菌株

生防菌株AL7是新疆棉田土壤中分离的一株具有广谱抑菌活性的甲基营养型芽孢杆菌，携带有四环素(tetracycline，Tet)抗性基因和gfp基因[11]。

1.1.3 供试土壤

2017年6月中旬，在农业部库尔勒作物有害生物科学观测实验站棉花黄萎病病圃(E85.801821、E41.750644)采集军棉1号健康株与黄萎病株根围0～10、10～20和20～40 cm土层的土壤，各取3个重复，带回实验室4℃保存，备用。

1.2 方 法

1.2.1 棉花黄萎病发生程度以及滴灌时期调查

于6月15日起按全国统一病情分级标准调查库尔勒病圃内4个棉花品种的黄萎病发生情况。病情指数=∑(各级病株数×发病级别)/(调查总株数×4)×100。

记录棉田滴灌一水时间，于灌水1 d后测量水分渗透深度。

1.2.2 不同深度土层微菌核数量检测

配制选择性培养基[12]，称取3 g土壤样品用研钵研细，3份，分别放入盛有200 mL水的三角瓶中，加入少量玻璃珠，静置10 min，在200 r/min的摇床上摇30 min。然后倒入上层150 μm下层38 μm的双层细筛，在自来水下将泥土冲洗干净。留在下层筛网上的土壤残留物全部转移到50 mL三角瓶中，用无菌水定容到30 mL。将定容好的土样液每次均匀吸取2 mL于改良微菌核选择分离培养基表面均匀涂布，接种5皿，在超净工作台上吹干， 28℃下黑暗培养10 d检查。每5皿的检验结果数目之和就是所测1 g土样中所含棉花黄萎病菌微菌核的数量，3次重复。

1.2.3 生防菌AL7在土壤中的定植检测

将含有四环素抗性基因的生防菌AL7在含10 mg/L四环素的固体LB培养基上划线活化。待长出单菌落后，挑取单菌落接种于含有5 mL LB液体培养基的试管中，于摇床中37℃、200 r/min振荡摇培8 h。取30 μL此菌悬液接种到300 mL含有10 μg/mL四环素的LB液体培养基中，37℃，200 r/min摇床摇培3 d，离心收集菌体，用无菌水清洗菌体3次，最后用无菌水稀释到l×108cfu/mL的接种浓度，重复制备10份。在病圃内棉苗2叶期时棉花根围进行灌根，单株棉花根围灌根菌悬液量与滴灌水量尽量相同。分别于接种后5、20、40、60 d取棉花根围0～20 cm、20～40 cm耕层土样。利用选择平板稀释法回收土壤中菌株AL7[12]。

1.2.4 土壤浸提液对生防菌AL7生长量的影响

取棉花根围土壤250 g加入无菌水250 mL(室温振荡5 h静置24 h后取上层清液，3层滤纸过滤，再经0.45 μm 滤膜过滤，得1∶1原液，继而配制成1∶2、1∶4的土壤浸提液，置于4℃冰箱保存。将生防菌株AL7在LB培养基上活化，转入装有5 mL(液体LB培养液的试管中，30℃下180 r/min摇培4 h后，取1 mL(菌悬液分别接入配制好的1∶1、1∶2、1∶4的土壤浸提液，30℃，180 rpm/min摇培，每1 h利用分光光度计测菌悬液的OD600值，10 h后停止测量，根据OD600值画出菌株的生长曲线，评价土壤浸提液对生防菌AL7生长的影响。

1.2.5 生防菌对微菌核的抑制能力

将生防菌株AL7在固体LB培养基上划线活化，挑取单菌落接种于含有250 mL LB液体培养基的三角瓶中，于摇床中37℃、120 r/min振荡摇培2 d，制成AL7菌悬液；市场上购买某品牌生物菌剂制成推荐浓度悬液。将保存的病圃土壤放置于φ10 cm、深度10 cm的盆钵中，将上述制备好的生防菌AL7、生物菌剂悬液灌入盆钵中，使之全部浸透，10 d后均匀取盆钵中土壤，检测微菌核数量，并制备悬液灌第2次，10 d后再次均匀取盆钵中土壤，检测微菌核数量。设清水对照，3次重复。

校正抑制率(%)=[1-(处理后微菌核数量×对照前微菌核数量)/(处理前微菌核数量×对照后微菌核数量)]×100。

1.3 数据处理

利用Excel软件对数据进行整理、汇总并作图。

2 结果与分析

2.1 棉花黄萎病发生动态与滴灌

研究表明,6月初库尔勒棉田黄萎病已开始显症，6月15日黄萎病病圃内军棉1号的病情指数为8.67，至7月15日病情指数迅速升至63.92。同期相比，6月15日中棉49号的病情指数为0.71，至7月15日病情指数仅为0.58。中棉49号对黄萎病表现出极强的耐受性。图1

库尔勒棉区滴灌头水日期为6月中旬，病圃滴灌一水时期为6月19日，田间棉花黄萎病已显症。头水的渗透深度为32.0 cm，军棉1号的主根系平均长度为38.5 cm，平均株高为19.6 cm，发病棉株的维管束变色高度平均为15.5 cm。棉田滴一水时，黄萎病菌已经由主根系或侧根系完成侵染并沿维管束向上蔓延，并使棉花显现病症。滴施生物菌剂时期严重迟于黄萎病菌的侵染时间。且灌水的渗透深度与棉花根系长度相差6.5 cm，并不能完全将生防菌剂等输送至棉花根尖等易受黄萎病菌侵染的组织部位。

图1 不同棉花品种黄萎病发生动态Fig.1 Occurrence dynamics of Verticillium wilt in different cotton varieties

2.2 棉田不同深度土层中大丽轮枝菌微菌核数量

研究表明，健康与发病棉株根围土壤中棉花黄萎病菌微菌核的含量及垂直分布存在显著差异。健康棉株根围土中的微菌核总量为232个/g土，主要集中在0～10 cm土层中，该土层微菌核数量为224个/g土，占全部微菌核数量的96.6%；发病棉株根围土中微菌核总量为721个/g土，其中0～10 cm土层中微菌核含量为310个/g土，占总量的43.0%；10～20 cm土层中微菌核数量为366个/g土，占总量的50.8%；20-40 cm土层中微菌核数量为45个/g土，占总量的6.2%。图2，图3

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05), 误差线表示平均值的标准误差(n=4)

图3 土壤中分离出的大丽轮枝菌微菌核在选择性培养基上的生长状态Fig.3 Growth status of microsclerotia isolated from soil on selective medium

2.3 生防菌AL7在土壤中的定植

研究表明，接种5 d时，生防菌AL7在0～20 cm的土层中的定植数量为4.5×106个/g土，在20～40 cm的土层中AL7的定植数量为2.8×105个/g土；接种20 d时，AL7在土壤中的定植量开始降低，在0～20 cm的土层中定植数量为3.3×106个/g土，在20～40 cm土层中的定植数量为1.3×105个/g土；至40～60 d时，AL7在0～20 cm的土层中的定植量明显降低至约1×106个/g土，在20～40 cm土层中的定植数量约0.5×105个/g土。生防菌AL7未在土壤中自然增殖，其定植数量随着时间延长开始下降，20 d后下降较为明显，主要定植在0～20 cm的土层中。图4

图4 生防菌AL7在不同深度土层土壤中的定植(1×105)Fig.4 The colonization of bio-control bacteria AL7 in soil at different depths

2.4 土壤浸提液对生防菌AL7生长的影响

研究表明，经过10 h的培养，生防菌AL7在纯土壤浸提液处理中的OD600值始终最高，显著高于其它处理。而生防菌AL7在1/2和1/4土壤浸提液2个处理中0～7 h的OD600值与清水对照处理没有显著差异；在8～10 h阶段，生防菌AL7在1/2和1/4浸提液2个处理中的OD600值均超过了清水对照，且生防菌AL7在1/2浸提液处理的OD600值高于1/4浸提液处理。棉田土壤浸提液对生防菌的生长无抑制作用。图5

图5 土壤浸提液对生防菌生长量的影响Fig.5 The effect of soil extract on the growth of bio-control bacteria

2.5 生防菌AL7与生物菌剂对大丽轮枝菌微菌核的抑制作用

研究有明，生防菌AL7发酵原液首次施用10 d后，土壤中微菌核数量由253个/g土降至44个/g土；生物菌剂处理土壤中微菌核数量由264个/g土下降至181个/g土；而对照土壤中微菌核数量由393个/g土下降至205个/g土，经计算生防菌AL7发酵液的校正抑制率为66.7%，其200 X液的抑制率仅为5.0%；而生物菌剂处理的校正防效为负值，没有抑制效果。

第2次施用10 d后，生防菌AL7发酵原液处理土壤中微菌核数量下降至10个/g土，校正防效为70.5%，200 X液的校正抑制率仅为5.5%；而生物菌剂处理每克土壤中微菌核数量由上升至224个/g土，没有抑制效果，相反还促进微菌核数量增加了43个/g土。表1

表1 生防菌(生物菌剂)对大丽轮枝菌微菌核的抑制作用(个/g土)Table 1 Inhibitory effect of bio-control bacteria(agent)on the microsclerotia of Verticillium dahliae (per/g soil)

3 讨 论

3.1棉花黄萎病作为严重威胁新疆棉花生产的土传病害，难以防治，利用生物防治技术进行防控是一项重要措施[7-9]。诸如在营养钵育苗土和大盆钵移栽土中施用微生物有机肥对棉花黄萎病的防治率可达80%以上[13]；田间利用西兰花残体对黄萎病的防治效果达43.06%[14]，能够降低微菌核的数量[15]；多种生防菌制成有机改良剂能显著降低棉花黄萎病菌产生微菌核的能力，降低了棉花黄萎病的发病程度[6]，田间拌种和随水滴施枯草芽孢杆菌S37和S44对棉花黄萎病的防治效果可达30%～50%[16]；利用滴灌随水滴施枯草芽孢杆菌可湿性粉剂、哈茨木霉菌剂、中农绿康等生物药剂对棉花黄萎病的防治效果可达33.5%～70%以上[9]。

3.2在库尔勒棉区影响生防菌(菌剂)防治棉花黄萎病效果的首要因素是防治时期错位。由于库尔勒棉区没有实行北疆的干播湿出的栽培模式，滴施生防菌(菌剂)的时间延迟至6月中旬(头水)，此时与石磊等[9]相比推迟了50 d，没有在第一时间占据棉花根围生态位；而6月中旬棉花黄萎病已开始显症，防治时期的严重错位对于维管束系统侵染病害依然无效。

3.3生防菌在土壤中的定植、增殖能力决定其生防效果。研究中土壤浸提液并未抑制生防菌的生长，但是生防菌在棉田中的自然增殖能力较差，主要定植在0～20 cm土层中，在20～40 cm土层中的定植量较低，所以对20～40 cm土层中的黄萎病菌微菌核的抑制效果便会打折扣。

3.4库尔勒试验病田土壤中黄萎病菌微菌核含量高，发病棉株根围0～40 cm土层中微菌核平均含量约为240个/g土，核算总量约为3.1×107个，在如此大的病原菌基数下，棉花根系承受巨大的侵染压力。

3.5微菌核抗逆性强[5]，生防细菌(菌剂)对其仅有抑制生长作用而无杀死能力，生防细菌AL7的200 X发酵液对微菌核的抑制率非常低，仅为5.5%，尤为甚者生物菌剂对微菌核没有抑制效果，反而促进了其数量的增长，与Marzano等[17]、Olanya等[18]、Eo等[19]研究结果接近。

土传病原菌通常是从宿主根部的伤口或在初生根和次生根的交界处开始入侵，而生防菌对生态位点的提前占领能有效防止病原菌侵染植物根系[20]。

4 结 论

4.1库尔勒棉区随水滴施生物菌剂时间为6月中旬，较出苗期推迟约60 d，大大迟于棉花黄萎病菌的侵染始期。应探索适合当地的棉花干播湿出技术，提前施用生物菌剂。

4.2生防菌在土壤中的定植、自然增殖能力较差。应增施羊粪等有机肥，增加土壤中有机质的含量，改善土壤微生态并促进有益微生物的增长。

4.3重病田土壤中棉花黄萎病菌微菌核基数过大，达107数量级，甚至更高。重病棉田生防菌剂只能作为辅助措施，主要应依靠种植抗病品种。

4.4生防菌(菌剂)对土壤中微菌核的抑制能力较差。应施用以拮抗菌为主导包括促生、分解类有益微生物的微生物复合制剂，抑制病原真菌的同时提高作物的抗性以抵御病原菌的侵袭。