宫腔菌群调控宫腔微环境影响胚胎着床的研究进展

任姝晴，郭洁，宋殿荣

目前全球约有8%～12%的育龄夫妇遭受不孕症的困扰，不孕症的病因和治疗已成为研究重点[1]。近年辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）的发展为不孕症患者带来生育的希望，但目前每个体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）周期的活产率仅为25%～30%[2]。据报道大部分反复着床失败（repeated implantation failure，RIF）是由子宫内膜容受性不足引起的，因此，良好的子宫内膜容受性对胚胎着床具有重要意义。随着人体微生物组学研究的兴起，20 世纪初提出的“无菌子宫”这一传统理念越来越受到关注。在人类微生物组计划（Human Microbiome Project，HMP）的背景下，过去10 年下一代测序（next generation sequencing，NGS）技术的使用拓宽了微生物领域的研究，并提供了检测复杂微生物群落的可能性[3]，逐渐开展了某种特定微生物的存在对生殖的影响以及是否有助于胚胎植入和妊娠的研究[4]。女性生殖道微生物群可能影响包括受精、胚胎着床、胚胎生长以及妊娠维持等生殖过程。如果生殖道微生物群在妊娠前就影响了子宫的免疫微环境，这将显著影响子宫内膜容受性以及正常胎盘初始化形成的能力。现就宫腔菌群影响胚胎着床的可能机制作一综述。

1 宫腔共生菌群的构成

人体内居住着数万亿的微生物，共生菌群是人体内固有的正常菌群。正常情况下，宫腔菌群构成一个有机整体，始终维持着健康稳定的状态。目前对正常宫腔菌群构成的定义尚未达成共识，与阴道菌群相比，宫腔菌群数量较低，但多样性较高[5]。宫腔菌群的多样性和丰度由高到低依次为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门，厚壁菌门中的乳杆菌属是宫腔内的优势菌[6]。2018 年Kyono 等[7]经人工授精导管（减少阴道和宫颈的污染）取材，对7 名健康女性志愿者的子宫内膜组织进行16S 核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）测序发现，有6 名女性乳杆菌含量＞90%，另外还检测出了少量加德纳菌、链球菌、阿托波姆菌、双歧杆菌、纤毛菌、普雷沃菌和葡萄球菌。该研究还发现健康女性子宫内膜乳杆菌百分比在同一个月经周期不同阶段高度稳定，甚至在下一个周期也是稳定的。2022 年Moreno 等[6]的研究也表明乳杆菌是子宫内膜组织中最丰富的一个属，而其他细菌即厌氧菌，如阿托波姆菌、双歧杆菌和加德纳菌比例较低，构建共生细菌网络结构发现乳杆菌数量与加德纳菌、双歧杆菌和阿托波姆菌呈负相关，与共生菌梭状芽孢杆菌和链霉菌呈正相关。

另有研究认为宫腔菌群并非以乳杆菌为优势菌。2019 年Winters 等[8]在25 例因子宫肌瘤行子宫切除术患者的子宫样本中发现，子宫内膜微生物群主要由不动杆菌、梭状芽孢杆菌、丛毛单胞菌和假单胞菌组成，而子宫内乳杆菌属罕见，然而该研究并不能除外这些细菌与子宫肌瘤具有一定的相关性。同年，Leoni 等[9]纳入了19 例正常足月妊娠的剖宫产妇女，在新生儿分娩、胎盘和胎膜从子宫排出后不久，通过子宫内膜活检进行取样，发现6 个可分类的菌属（表皮菌属、大肠杆菌属、葡萄球菌属、不动杆菌属、链球菌属和棒状杆菌属），它们可能是核心子宫内膜微生物群的一部分。该研究为今后探讨细菌与成功妊娠间的关系提供了有用的信息。由于16S rRNA 测序不能区分活细菌或死细菌片段，子宫内膜微生物组是否包含真正活跃的微生物目前尚不清楚，因此，2021年Sola-Leyva 等[10]使用转录组测序技术对7 名健康育龄期女性的14 个配对样本（包括增殖期和分泌中期）的子宫内膜活检组织进行分析，发现了由5 326种具有转录活性的微生物群组成的健康女性子宫内膜微生物组，包括85%细菌、10%真菌、5%病毒和0.3%古细菌；其中肉毒梭状芽孢杆菌、嗜氢菌、肺炎克雷伯菌和巴斯德氏菌是最丰富的微生物。基于以上研究，是否所有女性都存在独特的宫腔菌群，检测到的细菌是否暂时或永久存在于子宫内以及宫腔内各种菌群的共生关系仍需进一步研究。

2 不孕症患者宫腔菌群对妊娠结局的影响

正常生理情况下，宫腔共生菌群对妊娠维持起着重要的作用，当共生菌群紊乱时会降低IVF 的成功率。研究认为宫腔内乳杆菌可为ET 和妊娠维持提供理想的宫腔内环境，但是目前有关宫腔菌群与生殖结局的相关性还未达成共识。2016 年Moreno等[11]报道，将子宫内膜液中的菌群分为以乳杆菌为主的菌群（Lactobacillus dominated microbiota，LDM）和非乳杆菌为主的菌群（non-Lactobacillus dominated microbiota，NLDM），LDM≥90%与胚胎着床率、妊娠率、持续妊娠率和活产率提高有关，而以加德纳菌属和链球菌属为优势菌的NLDM 对妊娠有着不良影响。有研究表明，加德纳菌、链球菌、肠球菌、葡萄球菌、支原体、脲原体、衣原体和奈瑟菌等微生物与慢性子宫内膜炎有关，进而对胚胎着床产生不利影响[12]。2019 年Kyono 等[13]的研究发现，LDM≥80%已达到胚胎植入条件，另外双歧杆菌占优势的子宫内膜菌群也创造了胚胎植入的良好环境。该研究还发现LDM组的妊娠率（58.9%）高于NLDM 组（47.2%），但差异无统计学意义（P＞0.05）。对于NLDM 患者，根据其个体的微生物状况使用抗生素或益生元/益生菌可提高胚胎着床率。该研究明确了不孕症患者的子宫内膜微生物状态对妊娠具有重要意义，恢复以乳杆菌为主的子宫内膜可能有利于胚胎植入。但也有研究结果相反，2019 年Hashimoto 等[14]对99 例进行IVF治疗的不孕症患者的子宫内膜组织进行16S rRNA测序，将子宫内膜微生物群分为菌群正常组（≥80%的乳杆菌和双歧杆菌属）和菌群失调组（＜80%的乳杆菌和双歧杆菌属，≥20%的其他细菌），2 组的胚胎着床率（52.9% vs.53.1%）、流产率（11.1% vs.5.9%）和妊娠率（52.9% vs.54.8%）差异无统计学意义（均P＞0.05），这表明不同的宫腔菌群特征不一定影响妊娠结局。2022 年Moreno 等[6]开展了一项前瞻性多中心观察性研究，对342 例不孕症患者的子宫内膜组织进行测序后发现，高丰度的乳杆菌与活产率有关，乳杆菌可能是IVF 治疗成功的生物标志物。接受IVF治疗的患者宫腔中阿托波姆菌、双歧杆菌、黄杆菌、加德纳菌、嗜血杆菌、克雷伯菌、奈瑟菌、葡萄球菌和链球菌的存在与较差的预后（如妊娠失败、生化妊娠或临床流产）有关，其中加德纳菌、克雷伯菌和链球菌在未妊娠患者中显著增加，克雷伯菌和葡萄球菌与临床流产有关，生化妊娠的患者以肠球菌居多。因此，推测接受IVF 治疗患者的妊娠结局受宫腔中细菌群落及其与宿主间相互作用的影响。蔺凯丽等[15]研究了37 例复发性流产患者（recurrent spontaneous abortion，RSA）和25 例正常早孕女性的生殖道菌群特征，与正常早孕女性相比，RSA 患者宫腔菌群多样性及个体间菌群结构相似度无显著变化（P＞0.05），但优势菌种发生改变。正常早孕女性宫腔优势菌种以卷曲乳杆菌为主，RSA 患者宫腔优势菌种为惰性乳杆菌，RSA 患者宫腔菌群中两歧双歧杆菌和不能培养的不动杆菌丰度显著减少（P＜0.05），而拟杆菌属、大肠埃希菌/志贺菌属和瘤胃菌属团显著增加（P＜0.05）。因此推测RSA 的发生与宫腔内优势菌群发生改变有关。

目前有关不孕症患者宫腔菌群的研究结果仍存在差异，这可能与受试者数量、受试人群种族、孕产史、生活习惯、是否合并其他妇科疾病、是否使用激素类药物、取样方法、取样时间和检测方法等有关，宫腔内微生物群的变化可能并不能完全解释IVF 治疗成功率的差异，但宿主对宫腔菌群状态的反应可能导致不孕。因此，深入了解微生物群与宿主的相互作用可能为宫腔菌群与IVF 治疗成功率间的关系提供信息。

3 宫腔共生菌群紊乱导致胚胎着床障碍的机制

3.1 宫腔共生菌群紊乱导致抗菌屏障损伤正常生理情况下，子宫内膜共生菌群与子宫内膜上皮细胞相互作用可形成抵御病原体的健康物理抗菌屏障，两者相结合诱发各种抗菌肽（antimicrobial peptide）向宫腔内释放。抗菌肽是一种有效的广谱抗菌蛋白，可破坏微生物膜影响代谢过程，其是上皮组织抵御各种病原体（包括细菌、真菌和一些病毒）蛋白水解酶的关键防御机制中的一部分[16-17]。此外，宫腔共生菌群还会诱导子宫内膜细胞产生黏液，并稳定子宫内膜细胞间的黏附连接和紧密连接[18-19]，加强子宫内膜黏膜屏障的完整性。宫腔共生菌群的定植抗性（抵抗病原体定殖的能力）能保护宿主免受感染，这可能是支持健康子宫微生物群的潜在机制。宫腔共生菌群也可能竞争细胞的受体，一项体外实验研究发现，生殖道中存在乳杆菌可防止淋病奈瑟菌附着于子宫内膜细胞[20]。因此，完整且稳定的上皮屏障是保护子宫内膜免受机会性致病微生物感染、定植及侵入的天然防御的一部分，但是目前关于具体致病微生物破坏宫腔抗菌屏障的机制尚不完全清楚。

3.2 宫腔共生菌群紊乱导致免疫细胞失衡胚胎植入是一个复杂的过程。成功的胚胎植入和妊娠维持有赖于胚胎和母体子宫内膜微环境的平衡，维持这个平衡的重要因素之一就是免疫细胞。子宫内膜中免疫细胞的数量和功能异常，必然会影响胚胎植入的过程以及妊娠的维持。研究表明宫腔内乳杆菌等能募集调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg 细胞），从而激活巨噬细胞，增强炎症反应，对早期胚胎着床起着积极作用[21]。然而宫腔内定植的拟杆菌中含有多糖A，可引起循环系统中CD4+辅助性T 细胞1（T helper type 1，Th1）的增加[22]，Th1/Th2 平衡偏向Th1 可能导致母体免疫耐受平衡受损而影响胚胎着床。另有研究显示，以革兰阴性菌为主的微小病原体可突破合体滋养细胞进入绒毛组织产生内毒素，诱导蜕膜中Th1 细胞比例升高，引起以Th1 主导的炎症因子的产生增多，如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-6 和IL-8，激活子宫内膜的炎症反应，最终导致母胎界面的功能受损，引起胚胎植入失败或者自然流产[23]。Wang 等[24]研究发现，慢性子宫内膜炎患者子宫内膜Th17 表达上调，转化生长因子α（transforming growth factor α，TGF-α）及IL-10 表达下调，提示慢性子宫内膜炎患者子宫内膜中Th17/Treg 细胞比例失衡引起促炎反应，最终导致RSA 或RIF 等不良生殖结局，而微生物病原体是导致慢性子宫内膜炎的重要病因。Chen 等[25]研究了因子宫内膜微生物群紊乱导致慢性子宫内膜炎的RIF 患者子宫内膜免疫微环境的变化，发现慢性子宫内膜炎组叶杆菌属和鞘氨醇单胞菌属的丰度显著高于非慢性子宫内膜炎组，这两种菌属与树突状细胞（dendritic cell，DC）、子宫自然杀伤（uterine natural killer，uNK）细胞以及Treg细胞数量呈正相关，而uNK 细胞的异常分化可能通过影响子宫内膜和（或）蜕膜细胞血管和滋养层的发育导致胚胎植入失败。该研究还提到这2 种菌属与巨噬细胞数量呈负相关，巨噬细胞是最常见的抗原呈递细胞，巨噬细胞引起的特定细胞因子变化可能对胚胎着床产生不利影响，这可能是子宫内膜微生物群影响子宫内膜容受性的重要机制之一。此外，宫腔共生菌群紊乱可通过激活uNK 细胞上的杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）与绒毛外滋养细胞（extravillous trophoblast，EVT）上的人类白细胞抗原C（human leukocyte antigen-C，HLA-C）和HLA-G 相互作用，促进EVT 侵袭、基质降解、血管生成以及最终的母体螺旋动脉重塑[26]。目前有关宫腔微生物与免疫细胞间的具体关系仍需进一步深入研究，免疫细胞失衡是某种特定微生物起主导作用还是共生菌群紊乱共同起作用以及菌群之间的协同或拮抗作用如何影响免疫细胞等问题均仍需要大量研究来证实。

3.3 宫腔共生菌群紊乱导致细胞因子异常正常生理情况下，宫腔内乳杆菌通过刺激宿主吞噬细胞的吞噬能力、刺激细胞产生各种细胞因子如IL-10、IL-12、TNF 和干扰素（interferon，IFN）等，增强宿主的免疫能力。不孕症患者宫腔内以非乳杆菌为主的特征菌如加德纳菌、普雷沃菌和伯克霍尔德菌等都属于革兰阴性杆菌，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性菌细胞外壁的重要组成成分，可以激活宿主细胞细胞膜表面的Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4），子宫内膜微生物菌群能与TLRs结合激活丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子κB（nuclear factorκB）信号通路并介导子宫内膜发生免疫炎性反应，导致大量细胞因子的表达，包括TNF-α、IL-6 和IL-1β等细胞因子的产生[27]。Kim 等[28]建立了三维胚胎体外种植模型，研究LPS 对滋养层细胞在子宫内膜上皮细胞上附着和生长的不利影响，发现使用LPS 处理可显著增加子宫内膜细胞中细胞因子C-X-C 趋化因子配体1 [chemokine (C-X-C motif) ligand 1，CXCL1]、IL-8 和IL-33 的mRNA 表达，并降低黏附分子ITGβ3（integrin beta 3）和ITGβ5 的蛋白表达，提示LPS 通过在母胎界面诱导过度炎症反应而降低子宫内膜容受性。此外，宫腔共生菌群紊乱可增加子宫中趋化因子CXCL1 和选择素E 水平，维持炎症反应并招募B 细胞，最终导致慢性子宫内膜炎的发生，提示子宫内膜功能障碍可导致结构改变和局灶性间质破裂，也就是说，宫腔共生菌群可能通过调节基因表达、改变上皮细胞通透性以及改变促炎反应和抗炎反应之间的平衡而对子宫内膜产生影响[29]。由此可见，宫腔共生菌群紊乱会诱发生殖道内宿主的免疫反应，增加促炎性细胞因子的产生，这可能会损害胚胎植入，并在IVF 周期中导致不良的临床结局。然而不同的宫腔微生物是否与细胞因子的改变以及妊娠的成功有关仍有待探讨。

3.4 宫腔共生菌群紊乱导致代谢产物异常宫腔共生菌群与宿主之间的相互作用产生了多种代谢产物，受这些代谢产物影响的代谢途径主要包括氨基酸、碳水化合物和脂质代谢，它们与生命活动密切相关。这些活动进一步影响宿主细胞功能、免疫力和疾病易感性，并帮助维持宿主生殖道微环境的平衡。Sun 等[30]研究发现不孕症患者宫腔内卷曲乳杆菌和惰性乳杆菌的丰度显著低于健康女性，提示这2 种细菌丰度可能与不孕症有关，进一步分析差异细菌的代谢通路发现在不孕症患者氨基酸代谢、辅助因子和维生素代谢以及其他次级代谢产物的生物合成更为活跃，异常微生物群的生物降解和代谢受到限制，不孕症患者降解氯烯烃等外源性物质以及通过细胞色素P450 代谢外源性物质的能力可能降低。目前有关不孕症患者宫腔微生物代谢产物的研究较少。有研究显示肠道微生物群的代谢产物，如短链脂肪酸可以促进特定微生物生长，抑制其他细菌生长，改善肠道菌群结构[31]，另外，短链脂肪酸，如醋酸盐、丁酸盐和丙酸盐具有改变多种细胞表观遗传状态的能力[32]。在人类生殖环境中，微生物代谢产物可直接（如通过短链脂肪酸）或间接（如酸化、碱化、炎症反应）对局部细胞和组织的适应产生影响。宫腔共生菌群紊乱产生异常的代谢产物在疾病的发生、发展过程中起着重要作用。所有相关的生殖过程，包括受精、着床、胎盘形成、免疫耐受和胚胎发育等，都可能因微环境失调而发生不利的改变[33]。

4 结语与展望

通过确立健康女性宫腔正常的共生菌群将有助于判别导致女性生育力下降的致病菌，并进行对应的干预，从而提高女性生育力。评估宫腔微生物群稳定性的纵向研究有助于识别细菌是短暂定植还是稳定存在。确定细菌的生存能力也将有助于区分微生物群是否在宫腔内长期存在。越来越多的证据表明生殖道微生物群与女性生殖健康有关，未来的研究应着眼于从病理生理机制方面研究宫腔微生物群的潜在功能，从而有助于发现疾病的发病机制。当宫腔内致病微生物导致宫腔共生菌群的结构和数量发生改变时，可能会引起抗菌屏障损伤、免疫细胞比例失衡、促炎因子释放增多和代谢产物异常，从而改变宫腔微环境影响胚胎着床。然而宫腔共生菌群的特征及特定微生物在胚胎着床中的作用尚未完全明确，有待进一步研究证实，这将有助于从宫腔微生态角度探讨不孕症治疗的新途径。