SGLT2抑制剂对糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化及I型胶原蛋白表达的影响

曹 冰，任 荣，陆 晨

(1. 新疆医科大学第一附属医院，新疆 乌鲁木齐 830000；2. 新疆医科大学第五附属医院，新疆 乌鲁木齐 830000)

糖尿病肾病是糖尿病患者的常见并发症，约有40%的糖尿病患者伴有不同程度的肾脏损伤，最终导致终末期肾脏病的发生[1]。目前糖尿病肾病的治疗以降低血糖、控制尿蛋白排泄为主，从而延缓肾脏病的进展。钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂是一种新型的降糖药物，其通过抑制SGLT2的转运作用使肾脏对葡萄糖重吸收减少，促进尿糖、尿钠的排出而发挥降糖作用[2]，同时具有减少蛋白尿排泄、改善肾纤维化等肾脏保护作用[3]。Ⅰ型胶原是细胞外基质的成分之一,是肾脏内主要的间质性胶原，其含量过多可导致细胞外基质的异常堆积，最后导致肾小球硬化及肾间质纤维化[4]。本实验通过观察SGLT2抑制剂卡格列净对糖尿病肾病大鼠肾功能、肾脏纤维化及肾组织中I型胶原蛋白表达的影响，探讨了其肾脏保护作用及可能机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠28只，8～10周龄，体重200～250 g，新疆医科大学第一附属医院动物饲养中心提供，动物生产许可证号：SCXK(新)2018-0003，于新疆医科大学动物实验中心进行繁育。饲养温度(23±3)℃，相对湿度40%～70%。研究经新疆医科大学实验动物伦理委员会审批通过(IACUC-20210425-14)。

1.2主要试剂 45%高脂饲料(日粮型，大鼠)，普通饲料(江苏协同公司)；链脲佐菌素(sigma公司)；卡格列净片(Janssen-CilagS.p.A.意大利，国药准字H20170375，规格：100 mg)；苏木素染液、伊红染液、中性树胶(北京中杉金桥生物技术有限公司)；血糖、尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)、三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)测定试剂盒(南京建成)；Rabbit Anti-Collagen I antibody(博奥森)。

1.3主要仪器 罗氏血糖仪家用血糖试纸(罗氏卓越型)；电热恒温培养箱(上海精宏试验设备有限公司，DNP-9272)；酶标仪(美国Bio-Rad xMarkTM)；高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技公司)；漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；电泳仪(北京六一DYCZ-21)；化学发光成像仪系统(上海勤翔科学仪器有限公司Chemiscope 3000)。

1.4实验方法 将28只雄性SD大鼠普通饲料适应性喂养1周后,采用随机数字表法分为正常组(8只)、糖尿病肾病组(10只)、卡格列净组(10只)。正常组大鼠继续给予普通饲料喂养，糖尿病肾病组和卡格列净组大鼠给予高脂高糖饲料喂养。于分组喂养第5周第1天，糖尿病肾病组和卡格列净组给予链脲佐菌素50 mg/kg(pH 4.45、0.01 mol/L无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)腹腔注射，正常组注射等体积溶剂。注射第3天测随机血糖1次，对血糖低于11.1 mmo/L的大鼠再注射链脲佐菌素50 mg/kg，7 d后连续3 d尾静脉取血测随机血糖≥16.7 mmo/L，且尿白蛋白升高，出现多饮、多食、多尿、体重下降的典型“三多一少”症状，毛发枯黄、精神萎靡、反应迟钝等则证明造模成功。次日开始卡格列净组给予卡格列净10 mg/kg灌胃，正常组及糖尿病肾病组给予等体积蒸馏水灌胃，均1次/d，持续灌胃37 d。

1.5检测指标及方法

1.5.1尿蛋白含量 注射链脲佐菌素第1，2，3天及灌胃37 d处死前1 d收集各组大鼠24 h尿液，保存于-80 ℃冰箱,采用尿蛋白定量测试盒检测尿蛋白定量。

1.5.2血液学指标 灌胃37 d后禁食12 h，麻醉各组大鼠，收集腹腔动脉血1～2 mL，分离血清，按照各指标试剂盒说明书检测血糖、血尿素氮、血肌酐、总胆固醇、三酰甘油水平。

1.5.3肾组织病理形态 大鼠处死后，收集肾脏组织，称重后一份用多聚甲醛固定，用于石蜡切片制备(HE染色、Masson染色)；一份用戊二醛固定用于电镜检测。①HE染色:取各组固定于多聚甲醛中的大鼠肾脏组织,进行烤片、脱蜡、水化，苏木素染色，盐酸酒精分化数秒，自来水中终止分化5 min，脱水，伊红复染，透明，中性树胶封片。②Masson染色：取各组固定于多聚甲醛中的大鼠肾脏组织,进行烤片、脱蜡、水化，温热水漂洗，染色前先用蒸馏水润湿玻片30～60 s；分别进行R1核染液、R2浆染液染色，R3黄色分色液分色，弃去分色液后直接用R4蓝色复染液染色5 min左右，倒丢，用无水乙醇冲洗干净,中性树胶封片。

1.5.4肾组织中Ⅰ型胶原蛋白表达情况 采用免疫组化法检测：取制备好的肾脏组织石蜡切片，经烤片、脱蜡、水化、抗原修复、去除内源性过氧化物酶、洗涤、一抗孵育、再洗涤、二抗孵育、再洗涤、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液、再洗涤、显色、终止染色、复染、自来水中反蓝、脱水、透明、中性树胶封片、37 ℃烤片过夜等操作后，在光学显微镜下对组织切片按染色强度(0，1,2，3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)和阳性范围进行评分(无阳性表达为0分，阳性范围 1%～25%为1分，阳性范围26%～50%为2分，阳性范围51%～75%为3分，阳性范围76%～100%为4分)，两项评分分数相乘即为IHC评分。

2 结 果

2.1各组大鼠尿蛋白定量比较 糖尿病肾病组和卡格列净组注射链脲佐菌素第1～3天及灌胃37 d处死前1 d尿蛋白定量均明显高于正常组(P均<0.05)，糖尿病肾病组和卡格列净组注射链脲佐菌素第1～3天尿蛋白定量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，卡格列净组灌胃37 d处死前1 d尿蛋白定量明显低于糖尿病肾病组(P<0.05)。 见图1。

图1 正常组和糖尿病肾病各组大鼠不同时间点尿蛋白定量

2.2各组大鼠血液学指标比较 糖尿病肾病组大鼠血糖、BUN、Cr、TG、TC水平均明显高于正常组(P均<0.05)，卡格列净组大鼠血糖、BUN、Cr、TG、TC水平均明显低于糖尿病肾病组(P均<0.05)。见表1。

表1 正常组和糖尿病肾病各组大鼠血糖、BUN、Cr、TG、TC水平比较

2.3各组大鼠肾脏组织HE染色表现 正常组肾组织结构正常，肾小球及肾小管未见异常；糖尿病肾病组肾组织结构稍紊乱，肾小球部分萎缩、部分增大，毛细血管狭窄，系膜基质增生，部分肾小管上皮细胞肿胀或脱失；与糖尿病肾病组比较，卡格列净组肾小球毛细血管狭窄、系膜基质增生程度、肾小管上皮病变程度均较轻。见图2。

图2 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾脏组织HE染色光镜下表现

2.4各组大鼠肾脏组织 Masson染色表现 正常组大鼠肾脏纤维组织增生不明显，糖尿病肾病组大鼠肾小球及间质明显纤维化，卡格列净组大鼠肾小球及间质纤维化程度稍轻于糖尿病肾病组。见图3。

图3 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾脏组织Masson染色光镜下表现

2.5各组大鼠肾脏组织电镜下表现 正常组大鼠肾脏组织基底膜结构清晰,内皮细胞、基底膜及足突细胞完整,基底膜厚度为(0.154±0.013)nm；糖尿病肾病组大鼠肾脏组织毛细血管襻开放良好，内皮细胞无明显增生，系膜细胞和系膜基质轻度增生，系膜区轻度增宽，可见部分足突融合，基底膜厚度为(0.216±0.045)nm，明显厚于正常组(P<0.05)；卡格列净组大鼠的足突融合较糖尿病肾病组轻，基底膜厚度为(0.185±0.036)nm，明显薄于糖尿病肾病组(P<0.05)。正常组、糖尿病肾病组、卡格列净组足凸根部宽度分别为(0.196±0.043)nm、(0.230±0.039)nm、(0.202±0.030)nm,组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图4。

图4 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾脏组织电镜下表现(×25 000)

2.6各组大鼠肾脏组织I型胶原蛋白表达情况 正常组肾组织中I型胶原蛋白阳性表达及弱，IHC评分为(1.333±0.516)分；糖尿病肾病组肾组织中I型胶原蛋白阳性表达较强，IHC评分为(2.667±0.516)分，明显高于正常组(P<0.05)；卡格列净组肾组织中I型胶原蛋白阳性表达较糖尿病肾病组弱，IHC评分为(2.000±0.000)分，明显低于糖尿病肾病组(P<0.05)。见图5。

图5 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾脏组织中I型胶原蛋白表达情况(免疫组化染色)

3 讨 论

糖尿病肾病指糖尿病所致的慢性肾脏损害，临床上以白蛋白尿和(或)肾小球滤过率下降持续超过3个月为主要特征[5]。高血糖环境引起的糖基化终末产物的增加以及血流动力学的变化，导致炎症介质释放，会引起肾小球超滤、肾小球高压、肾肥大和肾小球组成改变，临床表现为蛋白尿和高血压，病理学上肾小球毛细血管基底膜增厚和系膜区扩张、肾脏发生细胞外基质沉积(主要是系膜)、肾小球基底膜增厚、肾小管萎缩等多种改变，最终导致间质纤维化和肾小球硬化[6]。既往研究表明，SGLT2的表达随着肾小球高滤过的增加而增加，从而导致系膜扩张，随着纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原的沉积，细胞外基质增多，进一步损害足细胞，加重肾小球硬化[7]。

SGLT2抑制剂可抑制肾小管对葡萄糖及钠的重吸收，更多的钠被输送到致密斑，导致入球小动脉扩张，肾小球内压降低和高滤过减少，从而引发一系列正向的直接、间接或反馈性的连锁反应而呈现出的综合效应：促进肾葡萄糖和钠排泄，进而降低机体代谢压力、体重，降低血容量、血压；改善心脏功能，减轻高葡萄糖导致的肾毒性(肾能量过度消耗、炎性反应、氧化应激、纤维化等)；减轻肾组织缺氧，恢复肾小管-小球反馈；缓解高滤过状态并降低蛋白尿，促进胰岛β细胞再生等[8-9]。Han等[10]研究表明，SGLT2抑制剂与噻唑烷二酮类药物一起作用，可以通过减少1型细胞因子和血管紧张素原来减轻系膜扩张。Nilsson等[11]发现SGLT2抑制剂即使在系膜细胞和足细胞中SGLT2表达较低时也能保护细胞不发生凋亡，还可通过增加肾小球系膜细胞和足细胞内自噬小体的形成来抑制细胞凋亡。Korbut等[12]研究发现，在db/db小鼠中，SGLT2抑制剂单独或与DPP-4抑制剂一起应用可促进肾小球自噬小体的形成。Wheeler等[13]报道，SGLT2抑制剂可以调节氧化应激和肾小球内炎症，从而减轻肾纤维化。2022年美国糖尿病协会(ADA)制定的《糖尿病诊疗标准》指出，SGLT2抑制剂可独立于血糖的机制降低肾小球囊内压及尿蛋白排泄并减缓肾小球滤过率的降低，且可抑制血管紧张素原的增加，减少超过50%的肾脏氧化应激，可为糖尿病患者提供长期的肾脏保护作用[14]。CREDENCE研究结果表明，SGLT2抑制剂可显著降低肾脏事件的复合硬终点，抑制尿白蛋白排泄，降低终末期肾脏病的发生风险[15]。

本实验结果显示，糖尿病肾病组和卡格列净组处死前1 d尿蛋白定量和灌胃结束后血糖、BUN、Cr、TG、TC水平均明显高于正常组，但卡格列净组上述各指标水平均明显低于糖尿病肾病组；病理观察显示，糖尿病肾病组肾小球部分萎缩，毛细血管狭窄，系膜基质增生，肾小球及间质明显纤维化，可见部分足突融合，基底膜增厚，卡格列净组上述病理改变均较糖尿病肾病组轻；肾组织中I型胶原蛋白阳性表达情况显示，糖尿病肾病组IHC评分明显高于正常组，卡格列净组明显低于糖尿病肾病组。提示SGLT2抑制剂卡格列净除了能降低血糖外，对糖尿病肾病还具有降脂、减少尿蛋白排泄、改善肾功能、减轻肾脏纤维化的作用，其抗肾脏纤维化的作用可能与其下调致纤维化因子I型胶原蛋白的表达相关。本研究结果为糖尿病肾病的防治提供了新的靶点药物，为SGLT2抑制剂的肾脏保护作用提供了更多基础研究证据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。