蒙药验方《亚日饮汤》提取物对H37RV感染小鼠血清IL-12的影响

布仁特古斯，陆 宇，马媛媛，照 娜，乌日古玛拉，图门乌力吉*

(1.内蒙古医科大学蒙医药学院，内蒙古 呼和浩特010010;2.北京市胸科医院 药物实验室;3.内蒙古医科大学附属医院 蒙医科)

结核病是严重危害人类健康的慢性传染病，其治疗以化学药物治疗杀灭结核分枝杆菌为主[1]。机体在清除结核分枝杆菌过程中CD4+Th1和CD8+T细胞介导的细胞免疫及其分泌的细胞因子如IFN-γ、IL-12起重要作用[2]。研究显示中医药在减轻抗结核药物毒副作用、逆转结核杆菌耐药情况以及抑菌、调整感染结核分枝杆菌的免疫水平方面取得了很好的疗效[3]。经临床对照研究发现《亚日饮汤》具有辅助治疗肺结核作用,在体内具有一定的抗结核杆菌活性[4]，其作用机理至今不清。研究发现该药体外并无抗结核杆菌作用，其代谢产物亦无直接抑制结核杆菌作用[5]。对于结核病体液免疫并无保护作用[6]，因此，认为该药可能通过提高机体细胞免疫功能来发挥治疗结核病作用的。结核病的发病与多种免疫细胞和细胞因子相关，IL-12是与结核病细胞免疫关系最密切的细胞因子之一[7]，故本研究通过气溶胶建立H37RV感染小鼠模型，给予亚日饮汤治疗后，采用ELISA法测定血清IL-12的水平，间接了解该药对细胞免疫功能的影响，预期揭示该药的可能作用机理。

1 材料与方法

1.1 试剂去离子水、1×PBS、2N H2SO4、吐温-20。ELISA检测试剂盒ELISA MAXTMDeluxe Set Mouse IL-12 kit购于Biolegend公司。包被板ELISA MAXTMUncoted Plates购于Biolegend公司。密封膜、1.5 ml离心管。

1.2 方法

气溶胶感染制备小鼠急性结核病模型，BALB/C小鼠，雄性，体重18-20 g，60只，分空白组;模型组;异烟肼组;亚日饮汤高、中、低剂量组，共6组，每组10只。亚日饮汤提取物小鼠灌胃高剂量每日每只216 mg一次灌胃，中剂量组每日每只108 mg一次灌胃，低剂量组每日每只54 mg一次灌胃，阳性药物组(异烟肼)20 mg/kg·天，空白组和模型组给予相同体积生理盐水(不超过1 ml)每日1次，造模后治疗28天。取腹主动脉血1 ml，室温静置凝血后以离心半径 3 cm，3 000 r/min离心20 min，取上清，灭活后过滤除菌保存，采用ELISA方法检测小鼠血清中IL-12，实验步骤按照“ ELISA MAXTM Deluxe Set Mouse IL-12 ”检测试剂盒说明书进行。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 制作标准曲线标准品OD450-OD570差值的均值及浓度值见表1。以标准品OD450-OD570差值的均值为横坐标，浓度为纵坐标，通过散点图添加趋势线的方法，制作标准曲线见图1。

表1 标准品OD450-OD570差值的均值及浓度值(pg/ml)

图1 血清IL-12标准曲线图

2.2 根据标准曲线计算样品浓度以OD450—OD570的差值为x值，代入标准曲线y=383.9x2+337.3x-7.124，y值即为样品浓度见图2。模型组、亚日饮汤高、中、低剂量组的水平高于空白组、异烟肼组(P<0.05)，亚日饮汤高、中、低剂量组的水平高于模型组(P<0.05)。见表2。

图2 血清IL-12

表2 血清IL-12浓度在空白组、模型组、异烟肼组、亚日饮汤组表达水平比较

3 讨论

结核分支杆菌感染机体后是否发病取决于结核杆菌的数量、毒力和机体的免疫状态。细胞免疫在抗结核保护性免疫中起主要作用[8]。IL-12是由p40和p35亚基(p35/p40)组成的异二聚体细胞因子，IL-12的p40亚基是巨噬细胞趋化因子，可将巨噬细胞趋化到炎症部位或肿瘤部位而增强固有免疫应答作用[9-10]。IL-12在抗结核的固有性免疫和适应性免疫中都发挥着关键性的生物学功能，结核杆菌对IL-12 p40亚基起到诱导作用，缺乏此细胞因子的人群对结核杆菌有明显的易感性[11]。Th1细胞是机体抗结核最重要的免疫细胞，IL-12主要通过对Th1细胞进行调节而参与抗结核的免疫反应，Th0向Th1分化中IL-12起到了无可取代的作用[12]。IL-12 p40对于针对结核分枝杆菌的保护性IFN-γ反应是绝对必需的，感染结核杆菌时机体巨噬细胞免疫功能低下，p40的生成减少，所以导致IL-12分泌减少，从而影响Th1细胞的生成分化，导致Th1/Th2细胞的表达失衡[13]。体内IL-12缺乏时,能导致结核杆菌在靶器官中持续生长繁殖[14]。本研究结果显示亚日饮汤高、中、低剂量组血清IL-12的水平高于空白组、模型组、异烟肼组(P<0.05)，表明亚日饮汤具有提高小鼠血清IL-12水平的作用，异烟肼组水平低于空白组，可能与异烟肼属于一线抗结核药物，具有直接杀伤结核杆菌作用，并非与提高免疫功能有关，空白组水平低于模型组，因空白组未曾受到H37RV感染，故只表现出固有免疫状态，模型组水平高于空白组和异烟肼组，是因模型组受到H37RV感染后，血清IL-12水平有所升高，表明小鼠原有免疫状态，但其水平升高明显不及亚日饮汤组。IL-12在免疫应答早期阶段诱导CD4+T细胞，自然杀伤(NK)细胞和NKT细胞产生IFN-γ[15-16]。IL-12具有刺激IFN-γ分泌作用，IFN-γ水平升高是否是通过提高IL-12水平来实现的有待于进一步研究。本研究另一项结果显示亚日饮汤具有提高小鼠血清IFN-γ水平的作用，与上述研究结果一致，二者的关联需进一步研究。综上，认为亚日饮汤可以提高H37RV感染小鼠模型血清中的IL-12水平，可能是亚日饮汤治疗结核病作用机制之一。