基于三苯胺的增强型Fe3+ 荧光探针及性能

尚主业 舒 丽 王 月 孟庆涛 贾宏敏 张志强

(辽宁科技大学 化学工程学院，辽宁 鞍山 114051)

1 引 言

Fe3＋是人体必需的微量元素[1-2]，在人的许多生理过程中扮演着重要的角色，例如氧气运输、DNA 合成、髓磷脂合成、线粒体呼吸、神经递质合成和代谢等[3-5]。而Fe3＋失衡会严重影响人们的身体健康，过量的Fe3＋会产生·OH 引起细胞损伤[6-8]，导致蛋白质、脂质、DNA 和碳水化合物的氧化和改性[9]，还会诱导β-地中海贫血、帕金森病、癫痫和阿尔茨海默病等疾病的发生[10-14]。对于血液、生物组织等样品中微量铁离子的精确测定是研究其吸收代谢的基础，同时Fe3＋也是反映人体健康状况的指标之一[15-16]，因此，对Fe3＋的检测和监测具有重要意义。

目前，检测Fe3＋离子的方法多种多样，包括电感耦合等离子体发射光谱法[17-18]、高效液相色谱法[19]、原子吸收光谱法[20-21]、原子荧光光谱[22]和电化学方法[23-25]等，但这些技术在检测中仍然面临高成本、操作繁琐、样品制备复杂等问题；而荧光探针具有选择性好、灵敏度高、操作简单和原位检测等优点[26-29]。由于Fe3＋具有顺磁性，所以目前报道的Fe3＋荧光探针大部分是猝灭型荧光探针，与荧光增强型探针相比，荧光猝灭型探针有较大的背景信号干扰且检测限相对较高[30]，对其性能研究具有一定的局限性。因此，开发新型的Fe3＋荧光增强型探针是非常有必要的。

三苯胺的氮原子具有较强的供电子能力，所以通过特定修饰的三苯胺具有独特的发光性能[31-33]。因此，开发出具有优越性能的三苯胺基荧光探针引起了越来越多科研工作者的关注。本文将5-(4-(二苯胺)苯基)噻吩-2-甲醛和4-氨基安替吡啉通过缩合反应制备出一种荧光增强型Fe3＋探针BL。在DMSO-HEPES 缓冲溶液中实现了对Fe3＋的特异性识别，同时考察了不同金属离子及pH 对BL 识别Fe3＋离子的影响。利用高分辨率质谱(HR-MS)、Job's plot 曲线和Benesi-Hildebrand 曲线验证了BL 对Fe3＋的识别机理。通过密度泛函理论(DFT)计算了识别Fe3＋前后轨道能级和电能的变化并解释了其荧光光谱现象。此外，该探针也被应用于自来水和瓶装水中Fe3＋的定量检测。

2 实 验

2.1 主要仪器与试剂

主要仪器:AVANCE 500MHZ 型核磁共振波谱仪(瑞士BRUKER 公司)；6530 Q-TOFLC/MC型液相质谱联用仪(安捷伦科技公司)；Lambda-900 型紫外分光光度计(美国P.E.仪器公司)；FS5 型爱丁堡荧光光谱仪(英国爱丁堡公司)；Nicolet iS-50 型红外光谱仪(美国Therom 公司)。

试剂:5-溴噻吩-2-甲醛、三苯胺-4-硼酸、四(三苯基膦)钯、4-氨基安替吡啉(分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；二氯甲烷、二甲亚砜、金属硝酸盐(Ca2＋、Ni2＋、Zn2＋、Ba2＋、Co3＋、K＋、Na＋、Ag＋、Cd2＋、Li＋、Pb2＋、Mg2＋、Al3＋、Cu2＋、Hg2＋、Cr3＋)(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；KNO3(分析纯，沈阳一化玻化学试剂)；FeNO3(分析纯，天津市光复科技发展有限公司)。所有试剂无需进一步纯化，直接使用。

2.2 探针合成与表征

2.2.1 5-(4-(二苯胺)苯基)噻吩-2-甲醛合成

称取5-溴噻吩-2-甲醛0.191 g(1 mmol)、四(三苯基膦)钯0.03 g(0.026 mmol)、10 mL 5 mol·L－1的K2CO3和20 mL 四氢呋喃(THF)于100 mL 烧瓶中，加热搅拌0.5 h。取三苯胺-4-硼酸0.347 g(1.2 mmol)溶于10 mL THF，加入上述溶液中。在N2保护下，90 ℃反应8 h。冷却，倒入水中，用二氯甲烷萃取，所得有机相用无水硫酸钠干燥，旋干，用二氯甲烷∶石油醚(v/v＝5∶1，Rf＝0.32)柱层析分离，得浅黄色固体，收率为70.2%。1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ(10－6):9.87(s，1H)，7.99(d，J＝4.0 Hz，1H)，7.68(d，J＝8.7 Hz，2H)，7.59(d，J＝4.0 Hz，1H)，7.35(t，J＝7.9 Hz，4H)，7.14(d，J＝7.4 Hz，2H)，7.11～7.07(m，4H)，6.96(d，J＝8.7 Hz，2H)。13C NMR(DMSO-d6，101 MHz)δ(10－6):184.10，153.38，149.02，146.89，141.35，139.86，130.21，127.86，126.02，125.43，124.55，124.42，122.18。ESIMS:m/z[M ＋H＋]＋＝356.111 5，计算值:356.110 4。

2.2.2 探针BL 合成

称取0.203 1 g(1 mmol)的4-氨基安替吡啉和0.355 1 g(1 mmol)的5-(4-(二苯胺)苯基)噻吩-2-甲醛，溶于20 mL 无水乙醇中，滴加2 mL 冰乙酸，回流10 h。反应结束后，抽滤，滤饼用10 mL 冷无水乙醇洗涤几次后放入真空干燥箱干燥，得黄色固体BL，产率为65%。1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)δ(10－6):9.65(s，1H)，7.63(d，J＝8.6 Hz，2H)，7.53(t，J＝7.8 Hz，2H)，7.46～7.41(m，2H)，7.38(t，J＝2.9 Hz，2H)，7.37～7.31(m，5H)，7.09(dd，J＝14.2，7.5 Hz，6H)，6.98(d，J＝8.7 Hz，2H)，3.16(s，3H)，2.40(s，3H)。13C NMR (101 MHz，DMSO-d6)δ(10－6):160.12，151.86，148.78，147.80，147.19，146.19，143.22，134.99，132.47，130.14，129.62，127.40，127.17，125.09，124.97，124.10，123.95，123.09，35.84，10.25。ESI-MS:m/z[M ＋H＋]＋＝541.206 6，计算值:541.206 2。探针BL 的合成路线如图1所示。

图1 探针BL 的合成路线Fig.1 The synthetic route of probe BL

2.2.3 测试所需溶液配制

(1)BL 储备液配制

取0.022 4 g 的BL 于100 mL 容量瓶中，用DMSO 定容，制得浓度为5×10－4mol·L－1的浓溶液(避光保存，备用)。测试时取出2.0 mL 浓溶液于100 mL 容量瓶中，用DMSO∶HEPES ＝5∶5的溶液稀释到1×10－5mol·L－1。

(2)金属离子溶液配制

称取一定量的各种金属离子硝酸盐于10 mL容量瓶中，用去离子水定容，配制成2×10－2mol·L－1金属离子溶液。

2.2.4 光谱测定

紫外-可见光谱(UV-Vis)和荧光光谱测试均在DMSO/HEPES(5∶5，v/v，pH ＝7.4，20 mmol·L－1)条件下进行。紫外光谱测量范围为275～550 nm。荧光光谱的激发波长为415 nm，狭缝宽度均为2 nm，测试时间为2 min。

3 结果与讨论

3.1 探针BL 识别Fe3+紫外光谱响应

利用紫外光谱考查了探针BL 对金属离子的选择性。由图2 可看出，当加入Fe3＋后，探针415 nm 处的紫外吸收强度增强，形成鲜明对比的是，加入其他金属离子如Ca2＋、Mg2＋、Ni2＋、Al3＋、Cu2＋、Hg2＋、Zn2＋、Ba2＋、Co3＋、K＋、Na＋、Ag＋、Cr3＋、Cd2＋、Li＋、Pb2＋后，探针的吸收光谱没有变化。表明探针BL 能够专一性识别Fe3＋。

图2 向探针BL(10 μmol·L－1)溶液中加入各种阳离子(70 μmol·L－1)(Ca2＋，Fe3＋，Mg2＋，Ni2＋，Al3＋，Cu2＋，Hg2＋，Zn2＋，Ba2＋，Co3＋，K＋，Na＋，Ag＋，Cr3＋，Cd2＋，Li＋，Pb2＋)的紫外-可见吸收选择光谱Fig.2 UV-Vis absorption spectra of BL(10 μmol·L－1)upon addition of various cations(70 μmol·L－1)(Ca2＋，Fe3＋，Mg2＋，Ni2＋，Al3＋，Cu2＋，Hg2＋，Zn2＋，Ba2＋，Co3＋，K＋，Na＋，Ag＋，Cr3＋，Cd2＋，Li＋，Pb2＋)

在DMSO/HEPES(5∶5，v/v，pH ＝7.4，20 mmol·L－1)缓冲溶液中，考查了不同浓度的Fe3＋对探针BL 紫外光谱的影响。如图3 所示，随着Fe3＋的加入，BL 在415 nm 处的紫外吸收峰逐渐增强，当加入Fe3＋(65 μmol·L－1)时，探针的紫外光谱不再变化。紫外滴定光谱表明探针BL 对Fe3＋有着良好的识别性能。

图3 向探针BL(10 μmol·L－1)溶液中逐渐加入Fe3＋(0～75 μmol·L－1)的紫外-可见光谱(插图为探针溶液在415 nm 处的吸光度随Fe3＋浓度变化的滴定曲线)Fig.3 UV-Vis absorption spectra of BL(10 μmol·L－1) in the presence of increasing amount of Fe3＋(0－ 75 μmol·L－1) (Inset:absorption of BL at 415 nm as a function of Fe3＋)

首先，利用荧光光谱考查了探针的光学稳定性，如图S10 所示，探针在20 h 内荧光强度无明显变化，说明探针具有良好的光稳定性，这为其后续的识别应用奠定了良好的基础。接下来进一步考查了探针BL对各种金属离子(Ca2＋，Mg2＋，Ni2＋，Al3＋，Cu2＋，Hg2＋，Zn2＋，Ba2＋，Co3＋，K＋，Na＋，Ag＋，Cr3＋，Cd2＋，Li＋，Pb2＋)的荧光识别性能。如图4(a)所示，探针BL 本身在538 nm 处表现出较弱的荧光发射，加入Fe3＋后探针的荧光明显增强且发射波长红移到550 nm，溶液的荧光颜色由蓝绿色变为黄色(图4(b))。在HEPES 缓冲液中，我们探究了BL 对Fe3＋的响应时间。如图S11 所示，向探针BL 中加入不同量的Fe3＋(0，25，50，75 μmol·L－1)后，荧光强度迅速上升并且在100 s 左右达到最高，表明探针BL 能在100 s 内完成对Fe3＋的检测。识别机理为Fe3＋的加入使探针的光诱导电子转移(PET)过程受到抑制从而使体系的荧光得以恢复。而加入其他金属离子对BL的荧光光谱则没有任何影响，实验结果表明该探针对Fe3＋的识别具有专一性。

图4 (a)向探针BL(10 μmol·L－1)溶液中加入各种阳离子(65 μmol·L－1)的荧光响应图；(b)向探针BL(10 μmol·L－1)溶液中加入各种阳离子的溶液荧光显色图(λex ＝365 nm)；(c)向探针BL(10 μmol·L－1)溶液中加入16 种其他金属离子(65 μmol·L－1)及加入Fe3＋(65 μmol·L－1)的荧光竞争图(λex ＝415 nm，λem ＝550 nm) (1.Blank，2.Fe3＋，3.Ca2＋，4.Cu2＋，5.Mg2＋，6.Ni2＋，7.Al3＋，8.Hg2＋，9.Zn2＋，10.Ba2＋，11.Co3＋，12.K＋，13.Na＋，14.Ag＋，15.Cr3＋，6.Cd2＋，17.Li＋，18.Pb2＋)。Fig.4 (a)Fluorescence responses of BL(10 μmol·L－1) in the presence of various cations(65 μmol·L－1).(b)Fluorescence color responses of BL(10 μmol·L－1) upon addition of various cations(λex ＝365 nm).(c)Fluorescence responses of BL(10 μmol·L－1) to 16 kinds of other metal ions (65 μmol·L－1) and Fe3＋(65 μmol·L－1)(λex ＝415 nm， λem ＝550 nm)(1.Blank，2.Fe3＋，3.Ca2＋，4.Cu2＋，5.Mg2＋，6.Ni2＋，7.Al3＋，8.Hg2＋，9.Zn2＋，10.Ba2＋，11.Co3＋，12.K＋，13.Na＋，14.Ag＋，15.Cr3＋，6.Cd2＋，17.Li＋，18.Pb2＋).

性能优良的探针若要能够实际应用，必须具备在干扰离子共存的环境下仍具有专一识别Fe3＋的能力。因此，本文对探针BL 识别Fe3＋的抗干扰性进行了测试。如图4(c)所示，在探针溶液中加入各种阳离子(3～18 号绿色柱)后，与探针原溶液(1 号绿色柱)相比，强度没有明显变化。而在含有干扰离子的探针溶液中继续加入Fe3＋后，其荧光强度均明显增强(3～18 号红色柱)，且与在探针溶液中仅加入Fe3＋的荧光强度(2 号红色柱)基本一致。这一结果表明探针BL 对Fe3＋的检测具有很强的抗干扰性。

在DMSO/HEPES(5∶5，v/v，pH ＝7.4，20 mmol·L－1)的缓冲条件下，进行了Fe3＋的荧光滴定实验。结果如图5 所示，随着Fe3＋浓度的增大，探针BL 的荧光强度逐渐增强且波长发生红移。从右上插图可以看出，当加入65 μmol·L－1Fe3＋时探针的荧光强度几乎不再发生变化，达到滴定终点。进一步测定了2 μmol·L－1下向探针BL 的溶液中加入不同浓度Fe3＋(0～8 μmol·L－1)后的荧光强度变化。如图S12 所示，探针BL 在550 nm 处的荧光强度与Fe3＋的浓度变化具有良好的线性关系(R2＝0.992 56)，通过计算得出探针BL 识别Fe3＋的最低检测限为0.165 μmol·L－1。

图5 向探针BL(10 μmol·L－1)溶液中逐渐加入Fe3＋(0～90 μmol·L－1)的荧光滴定图(插图为探针在550 nm 处的荧光强度随Fe3＋浓度变化的滴定曲线)(λex ＝415 nm)Fig.5 Fluorescence titration of probe BL(10 μmol·L－1) solution with gradual addition of Fe3＋(0－90 μmol·L－1) (Inset:fluorescence emission of BL at 550 nm as a function of Fe3＋concentration)(λex ＝415 nm)

利用Job's plot 曲线测定了探针BL 与Fe3＋的配位比。由图S13 可知，曲线最高点对应的横坐标为0.5，说明探针BL 与Fe3＋按1∶1进行配位。采用Benesi-Hildebrand 线性方程，按照1∶1配位模式进行线性拟合。如图6 所示，在550 nm处测得的荧光强度1/(F0－F)与1/[Fe3＋]呈现良好的线性关系(R2＝0.987 67)，这也证实了探针BL 和Fe3＋之间的1∶1化学计量关系。通过拟合方程可以计算出探针BL 识别Fe3＋的络合常数为1.603×104L·mol－1。

图6 探针BL (10 μmol·L－1)与Fe3＋按照1∶1配位模式的Benesi-Hildebrand 曲线图(λex ＝415 nm，λem ＝550 nm)Fig.6 Benesi-Hildebrand plot of BL(10 μmol·L－1) based on 1∶1 binding stoichiometry with Fe3＋(λex ＝415 nm， λem ＝550 nm)

为了探究探针BL 是否能够在不同pH 条件下识别Fe3＋，为此进行了探针的pH 依赖性实验。在DMSO/HEPES(5∶5，v/v，20 mmol·L－1)的条件下，在pH ＝4～11 范围内测试了探针以及加入65 μmol·L－1Fe3＋后的荧光发射强度。如图7所示，探针BL 的荧光强度并没有随着pH 值的改变而发生明显的变化，加入Fe3＋后探针的荧光强度大幅增强，并且在酸、碱环境下均可以实现对Fe3＋的有效识别。实验结果表明探针BL 具有在广泛pH 环境下的应用潜质。

图7 探针BL(10 μmol·L－1)溶液以及识别Fe3＋后的溶液在不同pH 值下的荧光强度曲线(λex ＝415 nm， λem ＝550 nm)Fig.7 Effects of pH on the fluorescence intensities of BL(10 μmol·L－1) in the absence and presence of Fe3＋(75 μmol·L－1)(λex ＝415 nm， λem ＝550 nm)

3.2 探针BL 识别Fe3+机理验证

探针BL 识别Fe3＋时，Fe3＋与噻吩上的S 原子、席夫碱上的N 原子和安替吡啉羰基上的O 原子发生配位，生成含有杂原子的两个五元环的稳定配合物。通过Job's plot 曲线和Benesi-Hildebrand 曲线已经测试出探针BL 与Fe3＋配位比为1∶1，为了更加直观地体现出BL 与Fe3＋的配位方式，我们利用HR-MS 进一步探究了BL 与Fe3＋所生成的产物。探针本身[BL ＋H＋]＋在m/z＝541.206 6 处显示出分子离子峰(图S5)。向探针BL 溶液中加入Fe3＋后，在m/z＝666.089 9 处观察到有新的离子峰生成(图S9)，推测该峰为[BL ＋Fe3＋＋2Cl－]＋的分子量。由此也验证了探针BL 与Fe3＋为1∶1络合(图8)。

图8 探针BL 对Fe3＋的响应机理图Fig.8 The response mechanism of probe BL of Fe3＋

3.3 理论计算

为了更深入地理解BL 对Fe3＋识别所产生的光谱变化，通过密度泛函理论计算了探针BL识别Fe3＋前后最优结构的能隙变化。如图9 所示，在与Fe3＋识别之前，BL 的HOMO 只有在安替吡啉的苯环上没有分布，在其余各部分均有分布；而BL 的LUMO 分布在噻吩、与噻吩相连的苯环、席夫碱和吡唑环部分。BL 的HOMO 和LUMO 轨道能级差为0.114 15 eV。在与Fe3＋识别之后，BLFe3＋的HOMO 主要分布在噻吩、席夫碱和Fe3＋上，在三苯胺和安替吡啉上的分布较少；而BLFe3＋的LUMO 主要分布在噻吩、席夫碱、Fe3＋和安替吡啉上，在三苯胺部分没有分布。此时HOMO 和LUMO 轨道能级差为0.084 00 eV。由于BL-Fe3＋的轨道能级差小于BL 的轨道能级差，所以发射光谱发生红移，这与实验结果相吻合。

图9 探针BL 与Fe3＋络合前后优化的分子几何结构、HOMO 和LUMO 轨道分布及相应的电能。Fig.9 The molecular geometry，HOMO and LUMO orbital distribution and the corresponding electrical energy were optimized before and after the probe BL complexed with Fe3＋.

3.5 实际水样中Fe3+的检测

为了验证探针BL 潜在应用前景，我们对自来水和在当地超市购买的瓶装水中不同浓度的Fe3＋(10，50，100 μmol·L－1) 进行了测定。所有测定水样中Fe3＋的回收率均在98.3%～103.5%之间。结果表明，探针BL 能够应用于实际水样中Fe3＋的定量检测，具有重要的应用价值。

表1 水样中Fe3+的检测结果Tab.1 Determination ofFe3＋in different water samples

4 结 论

本文设计并合成了一种以三苯胺为母体的Fe3＋荧光增强型探针BL，该探针对Fe3＋的识别具有较高的灵敏度、较广泛的pH 适用范围、良好的选择性以及较强的抗干扰能力，其检测限低至0.165 μmol·L－1。同时，加入Fe3＋后溶液的荧光颜色发生显著变化，能够达到“裸眼”识别的效果。通过高分辨率质谱也进一步证明了探针与Fe3＋为1∶1配位。利用密度泛函理论(DFT)计算了识别Fe3＋前后轨道能级和电能的变化并解释了其荧光光谱发生红移的现象。此外，该探针也成功应用于实际水样中Fe3＋的定量检测。

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