不同提取方法对白花前胡指标成分含量的影响

徐 广，谭秋生，杨 丹，傅 滟，郭 瑀，罗 川，罗 敏，邓才富

(重庆市药物种植研究所 中药材生产质量控制研究中心，重庆市道地药材规范化生产工程技术研究中心，重庆 南川 408435)

中药前胡为伞形科植物白花前胡PeucedanumpraerupterumDunn.的干燥根，具有降气化痰、疏散风热等功效。临床多用于外感风热、痰热喘咳、风热咳嗽等症[1]。现代研究表明，其主要药用活性成分为白花前胡甲素、白花前胡乙素等香豆素化合物，主要的药理作用为钙通道阻滞、降血压、抗心律、平喘、抗癌等[2]。目前，国内外对其药理活性[3-4]和鉴别研究较多[5-6]，对不同产地、野生和栽培的白花前胡指标成分分析也有报道[7-8]，但白花前胡提取方式对其指标成分的影响研究较少。笔者在对不同企业提供的样品开展质量分析的过程中，发现不同样品其内在成分的差异极其明显，因此，利用超声法和回流法对白花前胡样品进行不同方式提取，采用HPLC法测定白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量，研究两种提取方式对白花前胡成分的提取效果，探讨提取方式对白花前胡甲素和白花前胡乙素含量的影响，为前胡药材的质量评价提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

岛津LC-20AT高效液相色谱仪[包括LCsolution色谱管理处理软件、CTO-20A柱温箱、SIL-20A自动进样器、SPD-M20A二极管阵列检测器、日本岛津Shim-pack VP-ODS色谱柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)、CBM-20Alite系统控制器]、METTLER AL104型电子天平(感量：0.1 mg)，CPA225D型电子天平(感量：0.01 mg)，Molecular标准智能型纯水机，KQ-1000DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，DHG电热恒温鼓风干燥箱(上海龙跃仪器有限公司)，HH-8数显恒温水浴锅(上海汗诺仪器有限公司)。

1.2 材料

白花前胡样品均采自重庆市石柱县沙子镇青园村前胡种植基地，海拔高度1 130 m左右，选取种植基地土壤类型差异较为明显的沙壤土、棕紫土、灰棕紫泥和紫色夹砂土4种土壤类型所产药材样品，经重庆市药物种植研究所邓才富研究员鉴定为PeucedanumpraerupterumDunn.正品白花前胡。

1.3 试剂

甲醇(色谱纯)：重庆川东化工(集团)有限公司，批号：20190901；三氯甲烷：重庆川东化工(集团)有限公司，批号：20190702。水：均为临用现制的超纯水；白花前胡甲素、白花前胡乙素对照品：中国食品药品检定研究院，批号分别为111711-201904、111904-201804。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

按《中华人民共和国药典》2015年版一部(以下简称“药典”)“前胡”标准项下【含量测定】规定测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：Shim-pack VP-ODS色谱柱(4.6 mm×250 mm 5．0 μm)；以甲醇-水(75∶25)为流动相；检测波长为321 nm，理论塔板数按白花前胡甲素峰计算应不低于3 000。柱温：室温。

2.2 对照品溶液制备

精密称取白花前胡甲素、白花前胡乙素对照品适量，加甲醇制成每1 mL各含白花前胡甲素73.0 μg、白花前胡乙素79.8 μg的混合溶液，即得(色谱见图1)。

图1 白花前胡甲素(1)、白花前胡乙素(2)混合对照品色谱

2.3 供试品溶液制备

A：2015年版药典超声方法：取前胡样品粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，置250 mL具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率400 W，频率40 kHz)15 min，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液5 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

B：回流法：采用文献改进方法：取前胡样品粉末(过三号筛)约2.0 g，精密称定，加100 mL色谱纯甲醇回流6 h，过滤，滤液浓缩，取残渣，加甲醇溶解并定容至10 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 样品测定

精密称定各样品，按照“2.3”项下方法分别制备供试品溶液，按上述色谱条件进样10 μL，各色谱见图2，对测定峰面积进行积分，计算样品含量，见表2。

注：S1：沙壤土；S2：棕紫色土；S3：灰棕紫泥；S4：紫色夹砂土

表2 不同提取方式各样品指标成分含量 (%)

3 讨论

3.1 土壤类型对药材质量的影响

由表2数据可以看出，在同一管理模式下4种不同土壤类型中产出的白花前胡样品，其甲素和乙素的含量存在较大差异，表明不同土壤类型自身所含矿物质的差异对其所产药材内在质量有一定影响。其中，以2015年版药典超声法为参照，紫色夹砂土所产药材样品的白花前胡甲素含量为0.846%，不满足药典不低于0.9%的要求，其他3种土壤类型所产药材样品白花前胡甲素含量均能满足；而4种土壤类型所产药材样品的白花前胡乙素含量均低于药典0.24%的最低要求。表明生产企业在选择种植基地时不能忽略前期选址过程中对生态环境和具体土壤矿质养分的实际考量。

3.2 提取方式对药材指标成分检出量的影响

对比4组样品回流制样和超声制样分析结果可以发现，药典超声法提取制样较回流法提取制样处理后白花前胡甲素含量均低，回流法较药典超声法使白花前胡甲素提高了8.7%～21.9%，而白花前胡乙素含量则相反，药典超声法较回流法使白花前胡乙素提高了10.4%～21.95%。

回流法提取温度较高，所用溶剂甲醇极性较大；超声法提取温度相对较低，三氯甲烷极性相对小；对比白花前胡甲素和白花前胡乙素的热稳性，乙素须0～10 ℃避光保存表明乙素热稳性相对较差。4个样品白花前胡乙素含量在回流法提取条件下均低于超声法，可能是回流温度高，使白花前胡乙素有一定程度的破坏；且由于相似相容原理，通过对比白花前胡甲素和白花前胡乙素的HPLC出峰时间，推测甲素极性较乙素大，故乙素更易溶于极性较小的三氯甲烷中；反之，甲醇极性相对较大，甲素含量回流法均高于超声法。

《中华人民共和国药典》2015年版一部前胡项下的HPLC测定方法中供试品溶液的制备采用三氯甲烷为提取溶剂，三氯甲烷属于二类有毒试剂，对检验检测人员身体可产生一定程度的危害。而在现实生活中，中药的煎煮熬制并无危害人体健康的有机溶剂参与，因而应积极开展更贴近应用实际的检验检测方法研究，形成以生物评价为核心，以活性成分与生物活性相结合的中药整体质量评价方法，从而推动中药种植质量提升。