护肝布祖热颗粒对酒精诱导小鼠急性肝损伤的保护作用和作用机制

徐皓月，张珂，高旭杰，郭雪丽，徐修军，李国玉，王航宇，王金辉,2*

(1 石河子大学药学院/新疆植物药资源利用教育部重点实验室,新疆 石河子 832002;2 哈尔滨医科大学药学院,黑龙江 哈尔滨 150081)

酒精性急性肝损伤(Acute alcoholic liver injury)是一种因乙醇代谢产生乙醛进而对肝细胞产生损害，引发肝细胞出现氧化应激，炎症以及细胞凋亡反应的疾病，该疾病在发病后期容易引发酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化以及肝癌[1]。在目前酒文化盛行的社会中，酒精性急性肝损伤的发病率一直居高不下，所以开发可减轻酒精对肝细胞的损害的药物变得十分重要。

绝大部分乙醇进入人体后在上消化道被吸收进入体内循环并主要在肝脏中进行代谢[2]，在肝脏中乙醇可直接进入细胞中通过多种反应系统代谢成水和二氧化碳[3-4]，但在其代谢过程中产生的乙醛会对肝脏的功能以及细胞生理结构产生影响。乙醛可进入肝细胞内对细胞的代谢功能产生影响，使得肝脏中的脂质代谢出现障碍，促进脂肪酸的合成，抑制脂蛋白的表达，使大量脂肪堆积在肝组织内，导致脂肪性肝炎的发生[5]，因其破坏了细胞的线粒体，使细胞产生大量的活性氧，破坏细胞内的氧化/抗氧化平衡，引发机体的氧化应激进而激发炎症反应[6]，并使细胞内蛋白质合成过程出现错误，使细胞器出现损伤进而导致细胞凋亡，从而加重肝损伤[7]。在乙醛刺激肝细胞产生炎症反应后，不仅被激活的免疫炎性细胞分泌大量细胞因子对免疫系统产生影响，促进细胞发生凋亡，进而损伤肝功能[8]，还会促使细胞产生大量胶原，使酒精性脂肪肝和酒精性肝炎的发病率上升[9]，长期会导致肝纤维化和肝癌的发生[10]。

护肝布祖热颗粒是民族药中的一种复方，该复方由茴香根皮、芹菜籽、芹菜根、菊苣子、菊苣根、菟丝子以及小茴香组成，有着补益肝，胃，利肝，利胆的功效。有研究表明，护肝布祖热颗粒对脂肪肝患者有着较好的治疗作用[11]，并且其对四氯化碳引发的肝损伤有着抑制细胞凋亡、减轻肝细胞损伤的作用[12]。

本研究对护肝布祖热颗粒对酒精导致的急性肝损伤保护作用机制进行了一定的研究，为护肝布祖热颗粒后续的药物开发提供了一定的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择6-8周龄雄性昆明小鼠共72只，体重18～22 g。购自新疆医科大学，合格证号：SCXK(新)2019-0001。小鼠适应环境后，在实验周期内正常喂养。实验动物饲养于新疆石河子大学动物实验室，室温22 ℃±2 ℃，每天保持2 h空气畅通。实验由石河子大学伦理委员会批准，动物福利和实验程序符合石河子大学实验动物护理和使用条例。

1.2 实验仪器

JBA2002分析天平(上海浦春计量仪器有限公司)，Therrno 3001全自动多功能酶标仪(Thermo公司)，Axio Imager A蔡司正置荧光显微镜(北京冠普佳科技有限公司)，DYCZ-40D型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)，DYCZ-24DN型制胶器(北京六一生物科技有限公司)

1.3 实验试剂

护肝布祖热颗粒(批号：140334)：新疆维吾尔药业有限责任公司；复方益肝灵片(批号：20051201)：吉林博维药业有限公司；AST检测(批号：20200323)：南京建成；ALT检测(批号：C009-2-1)：南京建成；SOD检测(批号：A001-1)：南京建成；MDA检测(批号：A003-1)：南京建成；总胆红素检测(批号：C019-1)：南京建成；Bax(批号：BA0315)：武汉博士德公司；Bcl-2(批号：BA0412)：武汉博士德公司；NF-κB p65 Antibody(批号：#8242)：Cell Signaling technology；p-IκB α(批号：9246S)：Cell Signaling technology；β-actin Antibody：北京中杉金桥生物技术有限公司；牛血清白蛋白：北京索莱宝科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及给药

将72只昆明小鼠随机均分为6组，分别为：空白组，模型组，护肝布祖热颗粒低、中、高剂量组(1.25、2.5、5.0 g·kg-1)和阳性药复方益肝灵组(0.2 g·kg-1)。使用生理盐水溶解护肝布祖热颗粒并配制成不同浓度，对每组小鼠灌胃给予治疗药物，对于空白组给与生理盐水灌胃处理，持续14 d，在给药第13天时，对除空白组以外的小鼠给予无水乙醇灌胃(12 mL·kg-1)，建立酒精性急性肝损伤模型，空白组小鼠给予等体积的生理盐水灌胃处理。

1.4.2 样本收集

在末次给药12 h后，称重，麻醉，取小鼠肝组织，生理盐水洗净，吸去多余水分，称重，取左肝外叶组织放入10%甲醛中固定，其余肝组织存放入-80 ℃冰箱保存。

1.4.3 网络药理学分析

通过TCMSP数据库对护肝布祖热颗粒化学成分进行活性筛选，使用CTD数据库和GeneCards数据库筛选酒精性急性肝损伤相关靶点，并与护肝布祖热颗粒相关靶点进行比较，选出护肝布祖热颗粒治疗酒精性急性肝损伤的潜在靶标基因，通过String数据库筛选出护肝布祖热颗粒治疗酒精性急性肝损伤蛋白的相互作用关系，并使用Cytoscape 3.8.1软件，绘制出活性成分-靶点图以及相关靶点相互作用网络图并进行分析。

1.4.4 指标检测

将左肝外叶放入10%甲醛中固定48 h后对肝组织进行石蜡包埋，切片，进行HE染色，观察肝组织病理学改变；将肝组织左内叶制成10%的组织匀浆液，离心后取上清，进行ALT和AST活性，MDA，SOD以及总胆红素的含量的检测。

取肝右前叶，称取适量组织，提取肝组织内蛋白，使用蛋白质免疫印迹法检测肝组织中NF-kb p65，Bax，Bcl-2及p-Ikb ɑ蛋白表达水平，显色曝光后，用Image软件检测蛋白质条带的灰度值，并且将目的条带与相应的内参的灰度值相比后作图。

1.4.5 数据分析

所有数据均采用SPSS 17.0软件和GraphPad Prism软件进行统计分析。数据以均数±标准差(SD)表示。两组间采用单因素方差分析确定组间差距，并进行LSD检验。P<0.05有统计学意义，P<0.01为有极显著性差异，P>0.05为无显著性差异。

2 结果

2.1 护肝布组热颗粒通过抗炎和抗凋亡调节治疗酒精性急性肝损伤潜在靶点预测与分析

通过网络药理学筛选出护肝布祖热颗粒治疗酒精性急性肝损伤的潜在靶标938个，使用String数据库并使用Cytoscape 3.8.1软件，通过degree值的大小筛选出前50个相关靶点(图1)。

黄色：护肝布祖热颗粒治疗酒精性急性肝损伤相关靶点：蓝色：护肝布祖热颗粒活性成分CAS号；绿色：单味药材。图1 护肝布祖热颗粒治疗酒精性急性肝损伤的活性-靶点相互作用网路

分析筛选后发现其中相关的炎性靶点AKT1、MAPK1、MAPK14、TLR4、MMP9这5个靶标与护肝布祖热颗粒治疗酒精性急性肝损伤关系最密切，其主要涉及的通路有TLR4/NF-κB、PI3K-Akt、MAPK、FoxO、Ras信号通路等(图2)，这些通路主要与细胞内的氧化应激，炎症反应和细胞凋亡活动有关。可见护肝布祖热颗粒可通过影响细胞的氧化应激反应，降低炎症反应以及减少细胞凋亡，从而对酒精性急性肝损伤起到保护作用。

图2 护肝布祖热颗粒治疗酒精性急性肝损伤的蛋白-蛋白相互作用网路

2.2 护肝布祖热对酒精性肝损伤小鼠肝脏系数的影响

对各组小鼠的肝组织进行称重，并计算小鼠的肝脏系数=肝重量(mg)/ 体重(g)。对各组的肝脏系数进行统计后，从图3可看出，在给予大量乙醇灌胃建立急性肝损伤模型后，模型组小鼠的肝脏指数相比于空白组出现明显的上升(P<0.01)，在给予护肝布祖热颗粒治疗后，各治疗组的小鼠肝脏系数相较于模型组均出现下降，呈现出剂量依赖性，其中高剂量治疗组小鼠肝脏系数下降最为明显(P<0.01)。此结果说明，护肝布祖热颗粒可减轻酒精性肝损伤中肝细胞的水肿。

##P<0.01表示与模型组比较。*P<0.05表示与模型组比较。**P<0.01表示与模型组比较。图3 护肝布祖热颗粒对小鼠肝脏系数的影响

2.3 护肝布祖热颗粒对小鼠肝组织损伤程度的影响

为了进一步探讨护肝布祖热颗粒对急性肝损伤小鼠肝组织的影响，对小鼠肝组织的病理学指标进行检测，首先通过HE染色观察肝脏组织中炎性细胞浸润的情况以及肝细胞的损伤状况。从HE染色的结果可以看出：与空白组相比，模型组肝细胞出现部分肿胀，空泡型变性以及部分坏死，且网状支架坍塌，肝细胞索排列紊乱。而经过护肝布祖热颗粒给药治疗后，肝细胞空泡减少，细胞结构出现明显改善，肝细胞索排列恢复，呈现放射状。其中高剂量护肝布祖热颗粒治疗组变化最为明显。表明护肝布祖热颗粒可减少酒精性急性肝损伤中肝细胞的空泡性，减轻脂肪沉积，抑制肝细胞凋亡(图4)。

A：空白对照；B：模型；C：低剂量治疗组；D：中剂量治疗组；E：高剂量治疗组；F：阳性药组图4 HE染色(400×)

2.4 护肝布祖热颗粒对小鼠肝功能的影响

肝组织检测结果如图5所示，与空白组小鼠相比模型组小鼠肝组织中的ALT、AST活性均出现明显增加，且总胆红素含量增加(P<0.01)，在给予不同剂量的护肝布祖热颗粒后，ALT、AST以及总胆红素的含量相较于模型组均出现明显下降(P<0.05)，并呈现出一定的剂量依赖性。结果表明，护肝布祖热颗粒可减轻酒精性急性肝损伤造成的肝功能损伤。

与空白组相比##P<0.01；与模型组相比*P<0.05；与模型组相比**P<0.01图5 护肝布祖热颗粒对急性肝损伤小鼠肝组织中ALT，AST以及总胆红素的影响

2.5 护肝布祖热颗粒对小鼠肝脏抗氧化能力的影响

为了研究护肝布祖热颗粒对小鼠抗氧化能力影响，对小鼠的肝脏进行了SOD，MDA含量的检测。结果显示，模型组小鼠肝组织中的SOD活力相较于空白组显著下降，与之相反MDA含量显著上升(P<0.05)。而在给予护肝布祖热颗粒治疗后，和模型组相比治疗组的SOD值随着给药剂量的增加呈剂量依赖性增加，并有显著性差异(P<0.01)，而MDA含量则随着给药剂量的增加而出现明显的下降(P<0.05)。此结果表明，护肝布祖热颗粒可影响酒精性急性肝损伤的氧化/抗氧化平衡(图6)。

与空白组相比##P<0.01；与模型组相比*P<0.05；与模型组相比**P<0.01图6 护肝布祖热颗粒对急性肝损伤小鼠肝组织中SOD和MDA含量的影响

2.6 Western blot 实验结果

依据网络药理学的结果，使用Western blot方法对炎性通路和凋亡通路相关蛋白NF-кB p65，p-IκB ɑ，Bcl-2，Bax蛋白表达含量进行检测。

结果如图7所示，相比于空白组，模型组的NF-кB p65，p-IκB ɑ以及Bax蛋白水平出现明显升高，而Bcl-2蛋白表达下降，在护肝布祖热低、中、高各剂量组中NF-кB p65，p-IκB ɑ以及Bax蛋白表达水平出现明显下降，Bcl-2蛋白含量上升。结果表明，护肝布祖热颗粒通过减轻细胞炎症，抑制细胞凋亡从而对酒精性急性肝损伤起到一定的保护作用。

与空白组相比#P<0.05；与空白组相比##P<0.01；与模型组相比*P<0.05；与模型组相比**P<0.01图7 护肝布祖热颗粒对急性肝损伤小鼠肝组织中NF-кB p65，p-IκB ɑ，Bcl-2，Bax蛋白表达含量的影响

3 讨论

酒精性急性肝损伤是一种酒精进入人体后对肝脏产生损害的疾病，其因乙醇进入肝脏后破坏了肝细胞中线粒体的功能，影响了肝脏代谢过程[13]，进而激活肝脏内巨噬细胞并释放炎性因子，促进机体的炎症反应；刺激细胞线粒体激发氧化应激反应并且促使细胞凋亡。灌胃给药法建立酒精性急性肝损伤模型稳定性好，可重复性高，更接近人类饮酒模式[14]，所以本实验采用这种方法建立肝损伤模型并对护肝布祖热颗粒影响酒精性急性肝损伤的机制进行研究。

本研究探讨了护肝布祖热颗粒对酒精性急性肝损伤的肝功能的影响，测定了肝组织中ALT，AST以及总胆红素的含量。AST，ALT以及总胆红素是最常用的用于肝功能检测的指标[15]，其在肝细胞中有大量分布，并且因乙醇对肝细胞通透性造成影响而进入血液循环，所以一般对血液中的AST，ALT以及总胆红素含量进行测定以反映肝功能损伤程度。实验结果显示，护肝布祖热颗粒可明显降低酒精性肝损伤中的ALT，AST以及总胆红素的含量，表明护肝布祖热可对酒精性急性肝损伤导致的肝功能下降起到抑制作用。为了更好的判断护肝布祖热颗粒对于急性肝损伤的治疗效果，使用HE染色的方法观察肝组织的病理学变化，结果显示，护肝布祖热颗粒可明显减轻肝脏细胞空泡性，减少坏死的肝细胞数量以及修复肝细胞的结构。本研究对肝组织内的SOD，MDA含量进行检测，进一步研究护肝布祖热颗粒对急性肝损伤中氧化应激反应的影响。因乙醇进入肝细胞影响肝细胞的代谢，从而产生了大量的活性氧(ROS)，大量的ROS会破坏细胞的生理状态，并导致细胞凋亡。机体为了应对大量的ROS分泌激发了体内的抗氧化酶以抑制因过量的活性氧而引发的脂质过氧化反应[16]。MDA一般作为细胞氧化损伤程度指标，其主要由ROS引发的脂质氧化产生的，其与SOD的比值一般被用于判断机体内的氧化/抗氧化平衡[17]。本研究中结果显示，护肝布祖热颗粒可通过促进抗氧化酶SOD活力上升，抑制MDA的含量调节氧化/抗氧化平衡，减轻酒精性急性肝损伤中的细胞氧化应激反应。

本研究为了进一步探讨护肝布祖热颗粒保护酒精性急性肝损伤的机制，使用网络药理学对相关的潜在靶点进行了分析，发现肝布祖热颗粒保护酒精性急性肝损伤的机制与减轻细胞炎症，抑制细胞凋亡通路有关，因此，我们根据网络药理学实验结果使用Western blot方法重点对MAPK通路进行研究。MAPK通路主要有ERK，JNK，P38 3条途径，影响了细胞的炎症，分化以及增值。一方面，炎症反应是肝损伤的重要反应之一，MAPK通路中的P38途径可通过影响巨噬细胞的活化，影响NFκB p65蛋白以及IκB ɑ的磷酸化，从而对细胞炎症产生影响，且NFκB p65的激活进一步影响巨噬细胞分泌细胞因子，加重炎症反应，激活MAPK通路中的P38途径。NF-κB p65主要参与炎症和免疫反应的调节，未激活的NF-κB p65主要存在于细胞的细胞质中，未被激活的NF-κB p65一般与NF-κB p65抑制剂(IκB)结合形成二聚体，主要通过NF-κB p65与其抑制剂(IκB)结合成的二聚体与IκB激酶结合所产生的生理信号激活[18]。当信号通路被激活时，IκB磷酸化，NF-κB p65进入细胞核并与DNA结合，促进多种信号分子的转录[19]，在NF-κB p65被激活后，促进巨噬细胞等炎性细胞加速分泌炎性细胞因子，进一步的加重机体的炎症反应。因此，我们通过对NF-κB p65以及p-IκB ɑ蛋白的表达水平进行测定，从而探究护肝布祖热颗粒对下游的炎症通路的影响。另一方面，细胞炎症反应也可影响细胞凋亡通路。MAPK通路中的JNK途径可对细胞凋亡进行调节，其抑制细胞凋亡通路的上游蛋白Bcl-2的表达[20]，促进凋亡蛋白Bad，Bax的表达。Bcl-2和Bax蛋白是细胞凋亡通路重要的调控蛋白，两者通过线粒体途径参与细胞凋亡调节。Bax蛋白可通过影响细胞凋亡的线粒体途径，使下游的细胞凋亡执行蛋白Caspase-3激活，进而促使细胞凋亡。而Bcl-2蛋白可与Bax蛋白形结合形成二聚体，并通过影响细胞内Ca2+的流动抑制Caspase-3的表达，从而抑制细胞凋亡。因此我们通过对Bcl-2以及其抑制蛋白Bax的表达水平进行测定，从而探究护肝布祖热颗粒对下游的凋亡通路的影响。本实验结果说明护肝布祖热颗粒可通过抑制NF-κB p65蛋白以及p-IκB ɑ蛋白的表达降低细胞炎症反应以及促进Bcl-2蛋白的表达，抑制Bax蛋白，调节Bcl-2/Bax的比例，进而减轻肝细胞的凋亡对酒精性急性肝损伤起到保护作用。

综上所述，护肝布祖热颗粒通过减轻细胞的炎症反应，减少细胞凋亡从而对酒精导致的肝脏损伤起到保护作用，但更详细的机制研究方面有待进一步深入研究。