没食子多酚与FeⅢ通过层层自组装法制备薄膜

王秋平，陈文，杨金香，马尚智，郭刚，周良学，田星，韩博*

(1 石河子大学药学院/新疆植物药资源与利用教育部重点实验室，新疆 石河子 832002;2 四川大学华西医院/生物治疗国家重点实验室/生物治疗协同创新中心，四川 成都 610041)

近年来，金属-酚醛网络(MPNs)结构的组装在制备功能性杂化材料方面受到广泛关注。MPNs是指由金属和酚类化合物形成的单配体和多配体结构。制备MPNs的原材料具有多样性[1]，常用的金属包括铁(FeⅢ)、铜(CuⅡ)、锌(ZnⅡ)等[2-4]，酚类化合物包括没食子酸、邻苯三酚、懈皮素等[5]。MPNs可通过一步组装和层层自组装等方法得到[6-7]，得到的多配体材料可以应用于磁共振成像、肿瘤的近红外光热疗法等[5]，提高了MPNs的实用性。然而，多配体的纯度和效果都不尽人意[1]。

为了从没食子中提取纯度高、不含杂质的天然多酚，本文报道了一种简单的方法，并通过液相色谱-质谱(LC-MS)联用技术进行分析鉴定。没食子是没食子蜂科昆虫没食子蜂(Cynipsgallae-tinctoriaeOliv.)的幼虫寄生于壳斗科植物没食子树(QuercusinfectoriaOliv.)幼枝上所产生的虫瘿，含有约50%～70%的多酚类化合物,2%～4%的没食子酸以及其他成分[8]。没食子多酚(TPs)具有抗菌、抗炎、抗氧化等多种药理活性，且抗炎活性及其可能的机制已被阐明[8-9]。

但到目前为止，还没有发现任何将TPs与金属离子制备成MPNs薄膜的报道。因此，在提取得到高纯度且具有生物活性的TPs基础上，本文将TPs制备成多配体MPNs薄膜，扩大没食子多酚和MPNs薄膜的应用范围。

作为协调驱动组装的一种方法，层层(LBL)自组装是一种可以形成多配体MPNs的连续组装策略。该方法操作简单，通用性强，适用于石英板、纳米颗粒等多种基底[6,10-11]。这种技术常被用来形成功能材料如MPNs薄膜和涂层[12]。制备的MPNs药物薄膜在生物医药、药物传递系统等方面具有广阔的应用前景[12-13]。

因此，本课题提取并鉴定没食子多酚的成分，采用LBL自组装法制备MPNs薄膜，探讨MPNs薄膜形成过程的影响因素，并对其体外抗氧化活性进行评价，如图1所示。期望在表皮和粘膜的抗炎治疗中中，LBL自组装的MPNs膜具有良好的应用前景。

图1 工作思路图

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器

Waters HPLC-MS 纯化制备系统(美国Waters公司，配有HPLC泵、二元梯度模块、样品管理器、紫外-可见检测器、QDa 检测器以及Mass Lynx 数据处理系统)；紫外-可见分光光度计(UV-2600，日本岛津公司)；傅立叶变换红外光谱仪(FTIR，Exus-470，日本岛津公司)；扫描电子显微镜(SEM，evo18，德国蔡司公司)。

1.1.2 材料与试剂

乙腈、甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；甲酸(质谱级，上海麦克林有限公司)；三氯化铁(FeCl3· 6H2O，纯度 ≥ 99.9%，天津市盛奥化学试剂有限公司)；聚乙烯亚胺(PEI，MW=25,000 Da，上海攻碧克新材料科技有限公司)；2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS+·，纯度 ≥ 98%，上海经科化学科技有限公司)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·，纯度96%，上海经科化学科技有限公司)。

没食子药材于2019年3月购自中国广东省广州市，由石河子大学药学院韩博教授鉴定，拉丁名是QuercusinfectoriaOliv.，标本(No.20190305)保存于新疆特色植物药资源重点实验室药剂组。

1.2 方法

1.2.1 从没食子中提取多酚类化合物

精确称取50.0 g干燥的没食子粉末，通过水回流提取3次，每次加入2 L蒸馏水，提取液分别用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯按1∶1的比例连续萃取3次，利用旋转蒸发仪将各萃取液分别进行浓缩，浓缩液分别标记、避光密封保存。

1.2.2 没食子多酚成分的LC-MS分析

采用HPLC-MS 分析没食子中多酚的成份，HPLC-MS条件为：C18柱(SunFire，Ф 4.6×250 mm，5 μm，Waters)；流动相A为0.2%甲酸水溶液，流动相B为色谱乙腈；梯度洗脱程序设置为0～8 min(93%A)，8～35 min(93%～80%A)，35～50 min(80%～70%A)，50～60 min(70%～0%A)；浓度：1 mg·mL-1；流速：1 mL·min-1；进样量：20 μL；光谱条件为220 nm。

ESI-MS 条件：负离子模式；扫描范围：100～1250(m/z)；源温度：150 ℃；干燥气温度：250 ℃；毛细管电压2.64 kV；锥孔电压50 V；碰撞电压45 V；去溶剂气体：N2，800 L/Hr。

1.2.3 多步组装TPs/FeⅢ薄膜

制备LBL自组装薄膜的基板是尺寸为44 mm×10 mm×1 mm的石英载玻片。使用前，用食人鱼溶液(30% H2O2∶98% H2SO4=1∶3)冲洗所有石英载玻片5 min，用大量Milli-Q水冲洗，然后在氮气流中干燥。之后，将清洁后的基质浸入PEI溶液(1 mg·mL-1，内含0.5 mol·L-1NaCl)中15分钟，然后在Milli-Q水中冲洗3次，并使用氮气干燥。随后，将具有PEI层的基板浸入TPS(3.2 mg·ml-1，pH 3.0)中10 min，Milli-Q水(pH 3.0)冲洗3次，氮气干燥。然后将石英载玻片浸入FeCl3溶液(0.8 mg·ml-1，pH 3.0)中10 min，Milli-Q水(pH 3.0)冲洗3次，氮气干燥。最后两个步骤循环重复，直到获得所需层数的薄膜。

1.2.4 表征

用紫外-可见分光光度计(UV-2600)记录紫外-可见吸收光谱，傅立叶变换红外(FTIR)光谱仪记录红外光谱的变化。在扫描电子显微镜上测量了薄膜和空白石英板的扫描电镜图像。

1.2.5 体外抗氧化活性的评价

1.2.5.1 清除DPPH·自由基的活性

用UV-2600在517 nm处测定DPPH·(0.5 mmol·L-1)在薄膜存在下的吸光度，评价其清除自由基的活性。评估的细节如下：将10 ml薄膜和2.5 mL DPPH·溶液充分混合，然后在37 ℃下将混合物保持在黑暗中。在517 nm波长下每2 min测量一次吸光度，称为A1。同样，测定甲醇和DPPH·溶液混合物的吸光度为A2；此外，为了排除样品本身对测定结果的干扰，测定甲醇混合物和薄膜的吸光度，记为A3。根据公式(1)计算TPS/FeⅢ薄膜对DPPH·的清除率(S%)[11]。

S%=[1-(A1-A3)/A2]×100%。

(1)

取下120 ml DPPH·溶液(0.5 mmol·L-1)与8 g NKA-9(大孔吸附树脂)混合，然后将混合物在37 ℃的黑暗中储存。之后，用Milli-Q水洗涤3次DPPH·负载树脂，每次20 mL。将前一步骤制备的各1 g的两份NKA-9分别放入两个试管中，分别加入5 mL甲醇和薄膜溶液。以适当的间隔适当摇晃试管，使大孔吸附树脂与薄膜溶液充分接触。最后，在室温下观察和记录了NKA-9的变色情况。

1.2.5.2 清除ABTS+·自由基的活性

预先制备了两种7 mmol·L-1ABTS+·和0.14 mol·L-1K2S2O8溶液。然后将这两种溶液等量混合，摇匀，在室温下、黑暗中反应。12 h后，用PBS(磷酸盐缓冲溶液)将溶液稀释成734 nm处的吸光度约为0.70±0.02单位的溶液。ABTS+·溶液应在使用前新鲜配制。将薄膜放入5 mL ABTS+·溶液中，使混合物在室温下避光保持一定时间。然后使用UV-2600记录734 nm处的吸光度，称为AS。除了使用PBS而不是ABTS+·溶液外，空白样品的制备方法相同。根据公式(2)计算TPS/FeⅢ薄膜对ABTS+·的清除率，结果为S(%)[14]。

S%=(1-AS/0.7)×100%。

(2)

此外，取在734 nm处吸光度为1.4±0.02单位的120 ml ABTS+·溶液，与8 g NKA-9混合，然后在黑暗和37 ℃条件下保持12 h，用Milli-Q水彻底清洗ABTS+·负载树脂。然后，将前一步骤制备的各1 g的两份NKA-9分别放入两个试管中，分别加入5 ml PBS(10 mmol·L-1，pH 7.4)和薄膜。以适当的间隔适当摇晃试管，使大孔吸附树脂与薄膜溶液充分接触。最后，在室温下观察和记录NKA-9的变色情况。

2 结果与讨论

2.1 LC-MS分析没食子多酚的成分

经LC-MS分析，从没食子中提取得到多酚类化合物的主要信息如图2所示。根据本课题组之前的研究[15]，溶液中的主要化合物依次是没食子酸(m/z 169)、双没食子酸(m/z 321)、二-O-没食子酰基葡萄糖(m/z 483)、三-O-没食子酰基葡萄糖(m/z 635)、四-O-没食子酰基葡萄糖(m/z 787)、五-O-没食子酰基葡萄糖(m/z 939，图中m/z 469为分子的碎片峰)、六-O-没食子酰基葡萄糖(m/z 1091，图中m/z 545为分子的碎片峰)。在给定的色谱条件下，用峰面积归一化法测定的上述主要化合物的含量分别为41.91%(m/z 169)、7.57%(m/z 321)、2.04%(m/z 483)、10.76%(m/z 635)、14.56%(m/z 787)、13.55%(m/z 939)和7.33%(m/z 1091)，占总峰面积(220 nm)的97.72%。

峰位分配：(1)没食子酸，(2)-(3)双没食子酸，(4)二-O-没食子酰基葡萄糖，(5)-(7)三-O-没食子酰基葡萄糖，(8)-(9)四-O-没食子酰基葡萄糖，(10)-(11)五-O-没食子酰基葡萄糖(12)-(13)六-O-没食子酰基葡萄糖图2 没食子馏分的成分分析

2.2 TPs/FeⅢ 薄膜的制备过程

2.2.1 TPs/FeⅢ薄膜的制备及表征

根据美国食品药品监督管理局的认可，FeⅢ在药物中的使用是安全的[6]。通过LBL自组装法将底物交替浸泡在TPs和FeⅢ溶液中制备TPs/FeⅢ薄膜，TPs和FeⅢ分别作为有机配体和无机交联剂，制备简单，价格低廉。第一层TPs的形成是因为TPs(带负电荷)和经PEI(带正电荷)处理的石英板带有相反的电荷，这使得结合更加牢固[7]。PEI很可能可以诱导多酚平均pKa(酸解离常数)的变化，进而引起的电荷的变化，所以，将多酚作为层层自组装的原材料[16]。在213 nm和276 nm处分别观察到两个纯TPs的吸收峰，这两个吸收峰主要是TPs中苯环共轭烯烃键π → π*转变的原因(图3)。

如图3A所示，由于薄膜中的苯基而引起的吸收峰分别红移到220和278 nm，表明TPs和FeⅢ之间通过电子云转移，多酚和FeⅢ形成了脱质子共轭物。与由TA(单宁)和PEG(聚乙二醇)形成的其他LBL组装生物材料不同[17]，薄膜显示吸光度和层数几乎成比例关系(图3B)。如图3B的内置插图，通过线性拟合，得到薄膜的吸光度值(A)与薄膜层数(a)的关系式是A=0.059 a-0.070(R2=0.976)。220 nm处的紫外吸收峰是薄膜中苯基的特征吸收峰，把此特征吸收峰的吸光度值看做薄膜厚度，即表明，薄膜的层数与厚度存在良好的线性关系。Frank Caruso和张永军也观察到了这种关系[7,14]，这可能是因为多酚之间的相互作用力相对较弱，另外一些材料可能会导致“先快后慢”的扩散。相比之下，多酚和FeⅢ之间的相互作用力相对较强，从而导致线性沉积。

薄膜形成的驱动力可能是两种材料之间的金属螯合作用。确切地说，许多多酚具有金属螯合的显著特征，通过提供结合位点，使金属离子更好地螯合，在金属离子配位过程中起到多齿配体的作用，从而在TPs和FeⅢ之间形成稳定的化合物[7]。因此，薄膜的形成在理论上是有依据的。为了证实薄膜的形成，对40层薄膜进行了FTIR光谱分析，研究了LBL薄膜中TPs与FeⅢ的相互作用。同时，对分离的PEI、TPs和FeⅢ也进行了FTIR分析。如图3C所示，光谱表明TPs的C=O(酯基)和Ar-OH(酚羟基)的伸缩振动分别在1 714和3 420 cm-1处具有特征吸收峰，在LBL薄膜中分别移动到1 614 cm-1和3 362 cm-1处，表明FeⅢ和酚羟基之间存在配位键。此外，在1 427 cm-1处观察到一条特征性的PEI分子带，这被认为是酰胺键(δN-H)的弯曲振动或酰胺键(VC-N)的拉伸振动，这表明薄膜在洗涤后，仍存在低含量的PEI。

为了尽可能减小空白石英板上的杂质对薄膜厚度的相对误差，观察随着层数的增加，薄膜在石英板上的堆积情况，采用扫描电镜对(TPs/FeⅢ)40薄膜的表面形貌进行了研究。如图3D，a和c是具有不同放大倍数的空白石英板(用食人鱼溶液和大量Milli-Q水清洗，并利用氮气干燥)的图像，b和d是(TPs/FeⅢ)40不同放大倍数的薄膜的图像。空白石英板表面光滑；然而，TPs和FeⅢ沉积的石英板表面粗糙，颗粒数量多，粒径均匀，偶尔会有局部堆积的颗粒。

图3 TPs/FeⅢ薄膜的表征

可能的原因是，当TPs和FeⅢ的结合以达到饱和状态时，还存在游离的FeⅢ。因此，TPs-FeIII复合物的聚集物可由过量的FeⅢ游离溶液形成，然后聚集到表面，导致颗粒的积聚以及薄膜的粗糙表面。总的来说，证明了TPs和FeⅢ具有良好的自组装性能，可以成功地制备出TPS/FeⅢ薄膜。

为了评价薄膜的厚度，通过SEM观察了(TPs/FeⅢ)10薄膜(TPs浓度是1.6 mg·mL-1，FeⅢ浓度是0.4 mg·mL-1)和空白石英板的横截面。在这之前，使用紫外分光光度计做(TPs/FeⅢ)10薄膜在220 nm下的定波长扫描，得到的紫外吸光度值为1.875。如图4所示，A是(TPs/FeⅢ)10的薄膜的图像，B是空白石英板的图像。通过扫描电镜的测量和计算，发现(TPs/FeⅢ)10薄膜的厚度约为114 nm。另外，AFM可以研究薄膜厚度与层数的关系，也可以形象直观地探究整个薄膜平面的厚度等情况。对于更准确的薄膜层数与厚度的关系，后续实验可通过AFM来探究。

综上所述，通过LBL自组装法，利用TPs和FeⅢ制备薄膜的层数和厚度之间存在良好的线性关系；同时，TPs和FeⅢ可以成功结合，形成的薄膜表面颗粒大小均匀，具有良好的表面形貌；薄膜的厚度可以控制在200 nm以内。

[TPs]=1.6 mg·mL-1,[FeⅢ]=0.4 mg·mL-1图4 (TPs/FeⅢ)10薄膜(A)和空白石英板(B)的SEM横切面图像

2.2.2 TPs/FeⅢ薄膜形成的影响因素

虽然已成功制备出表面形貌良好的薄膜，但LBL自组装所需的多步骤分层过程往往费时费力。为了减少人工干预，加快装配过程，研究了影响薄膜形成的各种因素。有趣的是，温度、酸碱度以及TPs和相应的FeⅢ的浓度都会影响薄膜的载药量(图5)。薄膜在220 nm处的吸光度可以反映其厚度，吸光度越大，薄膜越厚。随着温度和pH值的降低(图5A、B)、以及组装溶液的浓度的增加(图5C)，薄膜的载药量和厚度均增加。其中，温度影响较小，而TPs的酸碱度、浓度及相应的FeⅢ有对薄膜的载药量有显著影响。在不同的实验条件下，紫外光谱结果表明，所有薄膜均与薄膜层数的增加保持良好的线性生长关系。从线性增长关系出发，得到一条拟合直线及其方程。结果表明，在不同条件下，直线拟合方程的斜率越大，薄膜越容易形成，相同层数的薄膜越厚。

图5 不同条件下TPs/FeⅢ薄膜的生长

随着温度的升高(25 ℃，30 ℃，42 ℃)，相应谱线的斜率依次为0.079 7，0.078 1，0.073 2。也就是说，薄膜的厚度受温度的影响较小，说明薄膜可以在较宽的温度范围内制备。

为了研究酸碱度对药物膜形成的影响，选择了3.0～6.0的TPS和FeⅢ溶液的酸碱度。根据溶度积定律，FeⅢ形成不溶性氢氧化物的条件满足方程(3)：

[FeⅢ]×[OH-]3≥Ksp。

(3)

其中，Ksp是Fe(OH)3的溶解度积常数，约为6×10-39。

很明显，溶解产物与FeⅢ溶液的浓度有关。一般来说，溶液的浓度和酸碱度是相互关联的，本实验中的FeⅢ溶液遵循这一原理。例如，溶液在0.4 mg·mL-1和1.2 mg·mL-1下的pH分别约为2.5和2.0。因此，本实验选用0.8 mg·mL-1的溶液，其pH值小于6.0。也就是说，不同浓度FeⅢ溶液的pH值与FeⅢ的溶解度有关。

如图5B所示，pH值越小(介于3.0和6.0之间)，越有利于薄膜的形成。随着pH值的增加，相应的谱线斜率依次为0.112 6、0.080 4、0.059 9和0.044 1。这可能是因为随着pH值的增加，越来越多的FeⅢ成为不溶性氢氧化物，而越来越少的FeⅢ与TPS结合，通过金属螯合作用形成薄膜。

随着TPS和FeⅢ溶液浓度的增加，薄膜的形成似乎不饱和。组装溶液浓度越高，薄膜越厚，越容易形成。随着浓度的增加，(TPS/FeⅢ)10薄膜在220 nm处的吸光度依次为0.887、1.120、1.388和1.704。此外，相应谱线的斜率依次是0.091 4、0.112 6、0.137 5和0.166 9。溶液的浓度增加了一倍，但薄膜的厚度没有增加相同倍数。令人惊讶的是，(TPS/FeⅢ)10薄膜在220 nm处的浓度与吸光度之间仍然显示出良好的线性关系。

综上所述，在较低的温度和较低的酸碱度条件下，原料药浓度越高，薄膜的形成越快，载药量越高。

2.3 TPs/FeⅢ 薄膜的抗氧化活性研究

抗氧化作为多酚类化合物的主要生物活性之一，因此，TPs/FeⅢ薄膜的抗氧化活性也应该得到评估。其抗氧化能力的机制是，由于没食子多酚的自由基清除和金属铁离子的螯合作用[7]。在特定的酸碱度下，没食子多酚分子结构中的酚羟基，具有较强的供氢能力，能清除体内产生的氧自由基[18]。所以没食子多酚的离子化程度和浓度决定了化合物的抗氧化活性。

DPPH·自由基清除活性的评定主要通过记录DPPH·在517 nm处的吸光度值，以及负载NKA-9大孔吸附树脂的颜色变化(紫色变为黄色)来完成。随着DPPH·自由基吸附在树脂颗粒上，树脂颗粒颜色由白色变为紫色。然后，将紫色颗粒和薄膜浸泡在甲醇中。如图6A所示，大孔吸附树脂颗粒的颜色在12小时后逐渐消失。

同时，用紫外分光光度法(图6B)测定了517 nm时DPPH·的吸光度变化。随着时间的推移，清除率近似于先快后慢的曲线方程。换言之，自由基的清除率首先是急剧地增加，然后减慢。在实验中，紫色的大孔吸附树脂与薄膜接触10分钟后，清除率达到90%以上。这可能是因为在溶液中，自由基的数量是恒定的，而TPS是连续释放的。随着时间的推移，溶液中自由基的浓度逐渐降低，参与反应的DPPH·也随之降低。

通常情况下，材料的抗氧化活性也能通过蓝色或绿色的ABTS+·自由基的清除来评估[19]。抗氧化剂可以与自由基阳离子反应，并使其褪色，从而评估材料的抗氧化活性。为了评价LBL自组装薄膜是否保持抗氧化活性，首先将ABTS+·阳离子自由基固定在树脂颗粒上。然后，将TPs/FeⅢ薄膜和大孔吸附树脂颗粒浸入PBS中。

如图6C所示，颗粒颜色逐渐消失。作为空白对照，不含TPs/FeⅢ薄膜的树脂颗粒颜色几乎没有变化。同时，紫外-可见吸收光谱法被用于监测LBL自组装薄膜的自由基清除能力(图6D)。结果表明，在接触薄膜溶液后，自由基清除率开始时迅速增加，前10 min达到66.88%，后60 min内清除率增加到78.38%。

综上所述，通过直观地观察大孔吸附树脂的褪色，证实了LBL自组装薄膜仍能与DPPH·和ABTS+·发生反应，即它们仍保持能清除自由基的抗氧化活性。另外，由于酚羟基与FeⅢ在薄膜中的结合，FeⅢ与TPS的螯合可以改善多酚的稳定性，提高TPS的抗氧化性能。TPS/FeⅢ薄膜也具有持久的抗氧化活性。

培养基为10 mmol·L-1 PBS，pH 7.4，T=37 ℃。图6 层层自组装薄膜的抗氧化活性

3 结论

由金属螯合驱动的TPs/FeⅢ层层自组装薄膜已成功制备。TPs可以很容易地从没食子中提取和分离出来，多酚的负载可以通过调整组装层数等条件来控制，更重要的是，LBL薄膜仍然具有清除自由基的活性。制备的薄膜在食品保存、药物抗氧化涂层、口腔溃疡的治疗以及皮肤表面其他伤口炎症的防治等方面具有重要价值。这为利用富含多酚的植物药制备薄膜和开发没食子的经济价值提供了一个新的视角。