海滨雀稗PvSAMS1基因及外源SAM调控耐盐的生理机制

李炎朋,刘宇,郑钰莹,刘君,杨志民,李志华,张明,陈煜*

(1.南京农业大学草业学院,江苏 南京 210095;2.沭阳县周集乡美濮草坪种植专业合作社,江苏 沭阳 223600)

海滨雀稗(Paspalumvaginatum)是禾本科雀稗属多年生草本植物,原生于海滨沙滩上,属典型的非泌盐型盐生植物,具有很强的耐盐性。已有研究主要集中在海滨雀稗耐盐评价和生理机制研究上,通过形态、生理指标与NaCl浓度之间的回归分析,发现海滨雀稗耐NaCl阈值(261 mmol·L-1)显著高于结缕草(203 mmol·L-1)、狗牙根(135 mmol·L-1)、假俭草(131 mmol·L-1)[1]。海滨雀稗具有多种耐NaCl生理机制,如可通过合成脯氨酸、甘氨酸-甜菜碱及葫芦巴碱等有机渗透调节剂进行渗透调节[2],通过调整体内K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、Na+浓度达到离子平衡[3],或通过增加水分吸收[4]等途径缓解盐害,但对于其耐盐分子机制报道较少。

S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase,SAMS)是广泛存在于动植物以及微生物体内的胞内酶,催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的合成。SAM作为植物体内的主要甲基供体以及乙烯、多胺、生物素合成途径中的主要前体,参与多种生物代谢过程。已有研究发现,甲基化转移酶、乙烯和多胺参与多种生物和非生物胁迫响应过程;NaCl胁迫能诱导SAMS基因的上调表达,过表达黄瓜(CucumissativusL.)[5]、甜菜(BetavulgarisL.)[6]、番茄(Lycopersiconesculentum)[7]、大豆(GlycinemaxMerr.)[8]等的SAMS基因均能提高植物的耐盐性。

本课题组前期从转录组数据库中获得1个受NaCl胁迫诱导上调表达的PvSAMS1基因,在此基础上,本研究通过异源转化拟南芥阐明PvSAMS1基因的耐盐功能,再结合外源SAM处理探究其对海滨雀稗耐盐调控的作用,进而明确海滨雀稗SAM合成途径与耐盐性的关系。

1 材料与方法

1.1 PvSAMS1氨基酸序列分析和系统进化树分析

根据海滨雀稗转录组数据分析,我们发现1个NaCl盐诱导上调表达的SAMS家族成员PvSAMS1,通过NCBI数据库BlastP查找其他物种中SAMS1蛋白的同源序列。SAMS1蛋白保守区预测采用NCBI的蛋白保守区数据库(conserved domain database,CDD)完成。利用DNAMAN对PvSAMS1蛋白与其他物种的SAMS蛋白进行同源性分析;通过MEGA 7.0软件中的邻接法(Neighbor-joining)构建PvSAMS1蛋白系统进化树,并通过Bootstrap方法对进化树进行检测,Bootstrap值设置为1 000。

1.2 植物DNA、RNA提取及cDNA合成方法

采用Magen公司植物基因组DNA提取试剂盒(D3161-03)提取植物DNA。采用OMEGA公司植物总RNA提取试剂盒(R6827-01)提取植物总RNA。使用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT-PCR Kit(RR014A),以Oligo dT为引物合成cDNA第1条链。

1.3 载体构建方法

以合成的cDNA第1条链为模板,用含有EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切位点(下划线)的引物(PvSAMS1-ORF-F:gaattcgcATGGCGGCGGAGAGCTTCCTGT;PvSAMS1-ORF-R:gatatctTTATTAAGCGGATGCCTTGTCGAACTT)扩增PvSAMS1基因片段,连接pClone007载体后,双酶切pClone007-PvSAMS1载体,构建pENTR1A-PvSAMS1载体,最终使用LR重组酶构建pEarleyGate103-PvSAMS1载体。

1.4 拟南芥转化及检测

采用农杆菌花粉侵染法转化拟南芥[9],使用含20 mg·L-1草铵膦的MS固体培养基对转化后的拟南芥种子进行阳性苗筛选,获得T3代纯和株系,提取阳性苗DNA及RNA,分别进行PCR和RT-PCR检测。所用引物为PvSAMS1-FL-F:CCCTTCTCCTCCTTCCTCCTGC;PvSAMS1-FL-R:CGACGACGACATGGCTTGCT。PCR反应程序:98 ℃ 30 s;98 ℃ 10 s,70 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,30个循环;72 ℃ 5 min。

1.5 拟南芥培养及处理方法

将拟南芥T3代纯合株系和野生型(WT)种子用含有1.5%有效氯的NaClO溶液浸泡5 min,用无菌水冲洗5～6次后,放至4 ℃冰箱中春化48 h。将春化好的拟南芥种子均匀点布于固体1/2MS培养基上,设置NaCl胁迫处理(0、100和120 mmol·L-1NaCl),将其置于人工气候室内萌发。人工气候室光照/黑暗培养温度22 ℃/20 ℃,光照/黑暗培养时间12 h/12 h,相对湿度60%,培养15 d后拍照观察。

将黑色泡沫板裁剪成与浅盘周转箱相当的尺寸,打孔后插入去掉管底和盖子的0.5 mL离心管。待种子萌发至长出4～6片叶(7～9 d)时,用镊子将拟南芥苗小心移入浅盘周转箱,黑色泡沫板上每个孔洞内移入1株苗。浅盘周转箱内加1/4 Hoagland 营养液后,置于人工气候室。控制气候室内环境条件同上。4 d后,将营养液换为1/2 Hoagland 营养液。此后每隔4 d更换1次营养液。待拟南芥幼苗生长一致时(6～8 片叶),将处理组营养液中分别更换为含50和100 mmol·L-1NaCl的1/2 Hoagland 营养液,置于人工气候室,10 d后拍照,采样。

1.6 海滨雀稗NaCl胁迫处理方法

剪取成熟野生型海滨雀稗茎段15～20 cm,将叶片全部剪至0.5 cm 长。用海绵块包裹5～8根茎段中间后,插入打好孔的黑色泡沫板中固定,保证所有茎段至少有2个茎节完全浸没于1/2 Hoagland 营养液中,置于人工气候室内培养。环境条件:光照/黑暗培养时间14 h/10 h;光照/黑暗培养温度30 ℃/25 ℃,光照强度为500 μmol·m-2·s-1。对海滨雀稗分别添加0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mmol·L-1SAM后,施加 400 mmol·L-1NaCl处理,采用五点取样法测量每盆海滨雀稗的平均株高,筛选后续试验最适SAM浓度。插苗后培养至生长状态一致时,向SAM处理组营养液中加入0.5 mmol·L-1SAM,24 h后向NaCl处理组分别加入400和500 mmol·L-1NaCl,置于人工气候室,15 d后采样并拍照。

1.7 指标测定方法

取新鲜植物根,用刻度尺测量其地上部与地下部分界处到最远端根尖的距离(cm),即为根长。取新鲜植物整株,用吸水纸吸干植株表面水分,用分析天平测定其质量(g),即为生物量。测5个重复。叶片相对含水量测定参考Barrs等[10]的方法。叶片电解质渗漏率测定参考马晓寒等[11]的方法。采用电感耦合等离子体原子发射光谱仪(Thermo Fisher公司,ICP-AES6300型)测定Na+和K+含量。抗氧化相关指标[12]的测定:采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量,采用愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性,采用过氧化氢还原法测定过氧化氢酶(CAT)活性,采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用抗坏血酸氧化法测定抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性。采用上海酶联生物科技公司ELISA试剂盒测定SAM含量。

1.8 数据分析方法

用SPSS 13.0软件进行统计分析,采用Duncan’s法进行方差分析和多重比较,用Sigmaplot 12.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 PvSAMS1氨基酸序列分析和系统进化树分析

从海滨雀稗转录组数据库中获得全长PvSAMS1基因序列,最大开放阅读框(ORF)长度为1 185 bp,编码394个氨基酸。通过NCBI搜索到其他植物的SAMS蛋白序列,利用MEGA7.0构建系统进化树。从图1 可见,PvSAMS1与糜子(Panicummiliaceum)和黍(Panicumhallii)的SAMS亲缘关系最近,与其他植物中的SAMS亲缘关系较远。

图1 PvSAMS1蛋白的系统进化分析

利用NCBI的蛋白保守区数据库对PvSAMS1进行保守区预测,PvSAMS1具有甲硫氨酸腺苷转移酶的保守结构域,属于S-腺苷甲硫氨酸合成酶家族,利用Prosite数据库进行蛋白功能结构域预测,该蛋白含有3个SAMS蛋白的特征序列GHPDK、GAGDQGHMFGY和GGGAFSGKD。从图2可见:海滨雀稗PvSAMS1氨基酸序列与糜子、狗尾草(Setariaviridis)、粟(Setariaitalica)、高粱(Sorghumbicolor)、玉米(ZeamaysL.)、黍、水稻(OryzasativaL.)中SAMS氨基酸序列相似度分别为98.73%、98.48%、98.48%、98.48%、98.22%、98.22%和95.69%,说明PvSAMS1的氨基酸序列与其他植物的氨基酸序列具有较高的同源性。

图2 PvSAMS1与其他物种中SAMS的多种序列比对

2.2 PvSAMS1载体构建与过表达拟南芥株系获得

PCR结果表明,以海滨雀稗叶片cDNA为模板的PCR产物有1条清晰的条带(图3-A)。将该条带切胶回收后连接平末端载体pClone007,对该质粒进行测序,结果与转录组数据库中序列一致。双酶切质粒pClone007-PvSAMS1结果如图3-B。

对获得的拟南芥PvSAMS1基因过表达株系提取DNA进行PCR鉴定,提取RNA进行RT-PCR鉴定,电泳结果(图3-C)显示,DNA PCR及RT-PCR产物条带大小一致,均为PvSAMS1基因全长序列片段,表明4个株系均为转基因材料。

图3 PvSAMS1基因电泳图

2.3 过量表达PvSAMS1对拟南芥耐NaCl性的影响

2.3.1 NaCl胁迫下的幼苗根长及生物量随机选择2个过表达转基因株系(Line 2和Line 3)进行表型验证,将转基因株系T3代和野生型种子共同在含有不同浓度NaCl的1/2MS培养基上垂直放置培养,测量其根长及生物量(图4)。结果表明,在非NaCl胁迫正常生长条件下,野生型拟南芥和2个转基因株系的根长和生物量无显著差异,100和120 mmol·L-1NaCl处理显著降低拟南芥根系长度及生物量,随着NaCl浓度的增加,根长及生物量受抑制的程度也增加,但2个转基因株系(Line 2和Line 3)的根长和生物量均显著高于野生型。

图4 拟南芥NaCl胁迫下根长及生物量

2.3.2 NaCl胁迫下转基因拟南芥成苗的生长差异及生理指标分析如图5所示,处理前和非NaCl胁迫条件下,转基因和野生型拟南芥的叶片大小及叶片数量无显著差异,50和100 mmol·L-1NaCl胁迫下,2个转基因株系的生长均显著优于野生型拟南芥,转基因株系植株存活率显著高于野生型,转基因株系植株大小及叶片枯萎黄化等情况也明显优于野生型,同时表现出更高的叶片相对含水量和更低的电解质渗漏率。NaCl胁迫显著降低了拟南芥叶片和根系中SAM的积累,过量表达PvSAMS1能显著提高NaCl胁迫下的拟南芥根系和叶片中SAM的含量,而在对照非NaCl胁迫条件下,SAM的含量没有显著差异(图6)。

图5 PvSAMS1过表达株系及野生型拟南芥成苗NaCl胁迫下长势差异

图6 拟南芥转基因株系及野生型叶(A)和根(B)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)含量

离子检测数据(图7)显示,NaCl胁迫显著促进植株叶片和根系中Na+离子积累,降低K+离子吸收,进而降低K+/Na+值,随着NaCl浓度的升高,野生型与转基因株系的离子平衡状态受到的影响逐渐加剧。转基因植株中叶片和根系的Na+含量均显著低于野生型,K+含量显著高于野生型,保持更高的K+/Na+值。表明过量表达PvSAMS1能显著抑制Na+离子吸收,促进K+离子吸收,调节NaCl胁迫下离子平衡。

图7 拟南芥转基因株系及野生型叶、根部位Na+、K+含量及K+/Na+值

对抗氧化系统检测表明(图8、9),NaCl胁迫使叶片和根系中丙二醛(MDA)含量显著提高,但转基因株系中的MDA含量显著低于野生型。NaCl盐胁迫条件下,转基因株系及野生型根系和叶片中的抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性均随NaCl浓度的增加呈不同程度的下降,但转基因株系中的这4种抗氧化酶活性均显著高于野生型拟南芥。表明过量表达PvSAMS1通过促进抗氧化酶活性提高,降低NaCl胁迫下的氧化胁迫伤害。

图8 NaCl胁迫下拟南芥转基因株系及野生型叶片MDA含量及抗氧化酶活性

图9 NaCl胁迫下拟南芥转基因株系及野生型根部MDA含量及抗氧化酶活性

2.4 外源添加SAM对海滨雀稗耐盐性的影响

2.4.1 外源添加不同浓度SAM对海滨雀稗的影响从图10可知:0.5和0.1 mmol·L-1SAM处理的海滨雀稗株高显著高于其他处理,0.5 mmol·L-1SAM处理最高。1.0 mmol·L-1SAM处理株高略低于0 mmol·L-1SAM处理,但差异不显著。1.5、2.0 和2.5 mmol·L-1SAM处理株高显著低于0 mmol·L-1SAM处理,这3组均表现出明显的高浓度SAM毒害现象,植物生长受到明显抑制,叶片枯黄,生长缓慢。因此,0.5mmol·L-1SAM是合适的试验处理浓度。

图10 不同浓度SAM对海滨雀稗株高的影响

2.4.2 外源添加SAM对NaCl胁迫下海滨雀稗相对含水量及电解质渗漏率的影响从图11可知:在0、400和500 mmol·L-1NaCl浓度处理下,外源添加0.5 mmol·L-1SAM均能不同程度促进海滨雀稗的生长。表1结果表明,在非NaCl胁迫处理下,外源添加SAM的海滨雀稗叶片相对含水量与不添加SAM的海滨雀稗相比差异不显著。而在NaCl处理浓度为400和500 mmol·L-1时,外源添加SAM的海滨雀稗叶片相对含水量显著高于不添加SAM的海滨雀稗;当NaCl浓度从400 mmol·L-1增加到500 mmol·L-1时,未添加SAM组的海滨雀稗相对含水量显著降低,而添加SAM组的海滨雀稗相对含水量不变。在非NaCl胁迫处理时,外源添加SAM的海滨雀稗叶片电解质渗漏率与不添加SAM的海滨雀稗无显著差异。虽然随着NaCl浓度的增加电解质渗漏率有所增加,但在NaCl处理浓度为400和500 mmol·L-1时,外源添加SAM的海滨雀稗叶片电解质渗漏率显著低于不添加SAM的海滨雀稗。上述数据显示,添加 0.5 mmol·L-1SAM能显著缓解海滨雀稗在NaCl胁迫下的伤害。

表1 外源添加SAM对盐胁迫下海滨雀稗叶片相对含水量和电解质渗漏率的影响

图11 外源添加SAM对盐胁迫下海滨雀稗长势的影响

2.4.3 外源添加SAM对NaCl胁迫下海滨雀稗K+、Na+含量的影响从表2可知:非NaCl胁迫处理下,外源添加SAM与无添加SAM的海滨雀稗其叶片Na+含量差异不显著。在400和500 mmol·L-1NaCl胁迫条件下,外源添加SAM海滨雀稗叶片和根系中Na+含量均显著低于无SAM添加的海滨雀稗,其K+含量均显著高于无SAM添加的海滨雀稗。结果表明,添加SAM能抑制Na+积累,促进K+积累,维持更好的离子平衡状态,进而提高海滨雀稗耐盐性。

表2 外源添加SAM对NaCl胁迫下海滨雀稗K+、Na+含量的影响

3 讨论

盐胁迫直接影响植株的生长发育状况,明显降低种子发芽率,并且在形态上表现出植株矮小、萎蔫,甚至死亡的现象[13]。SAM是合成多胺和乙烯的重要前体,SAMS作为合成的关键酶,在调控植物耐盐途径中发挥重要作用[14]。海滨雀稗作为优异的暖季型草坪草,具有很强的耐盐性,我们前期从海滨雀稗转录组中获得1个NaCl诱导上调表达的PvSAMS1基因。本研究通过异源转化拟南芥发现,PvSAMS1过表达株系的叶片相对含水量高于野生型,电解质渗漏率低于野生型,说明其细胞保持了较高的完整性及较低的膜渗透率,证明PvSAMS1基因具有正调控植物耐盐性的功能。

植物在NaCl胁迫下有多种维持内部环境稳态的途径,包括离子调控、抗氧化、渗透调节等。为了缓解NaCl胁迫的伤害,植物已经建立了对土壤溶液中高渗透压成分和Na+的感知与响应能力[15]。K+在植物细胞中的积累平衡了Na+积累的毒性效应,NaCl胁迫期间的离子动态平衡需要维持稳定的K+获取和分配[16]。本试验表明,NaCl胁迫提高Na+在叶片的积累量,这与对其他作物的研究结果相一致[17]。PvSAMS1过表达拟南芥株系在NaCl胁迫下K+含量高于野生型,Na+含量低于野生型,表明PvSAMS1能提高拟南芥在NaCl胁迫下的离子平衡能力,保持细胞内更高的K+/Na+。有研究表明,在拟南芥中过表达乙烯合成酶基因,能提高拟南芥体内乙烯含量,可使植株体内的乙烯通过提高H+和Ca2+浓度从而降低Na+浓度,进而缓解植物受NaCl胁迫[18]。由于SAM是乙烯生物合成前体物质1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)的重要生物合成原料,我们推测过表达PvSAMS1基因提高SAM含量是通过促进乙烯合成从而间接提高植物在NaCl胁迫下的离子平衡能力。

植物在逆境胁迫下会诱发产生活性氧,过量的 ROS导致膜脂过氧化伤害[19-20]。研究显示抗氧化酶和非酶类化合物代谢在缓解NaCl胁迫诱导ROS产生的毒害中起着关键作用[21]。丙二醛(MDA)含量被普遍认为是评价植物NaCl胁迫下质膜过氧化损伤的指标[22-24]。本研究结果发现,PvSAMS1基因过表达株系在NaCl胁迫下的膜脂过氧化程度较低,APX、CAT、SOD、POD等抗氧化酶的活性显著高于野生型,表明PvSAMS1通过调节抗氧化酶活性来缓解NaCl胁迫下的氧化伤害。过表达PvSAMS1基因提高植株体内的SAM含量,促进多胺合成,多胺在植物体内氧化可诱导植物抗氧化酶活性的提高[25]。

SAMS是直接合成SAM的限速酶,SAM含量可在一定程度上反映其合成酶SAMS的表达量及活性[26-27]。在非NaCl胁迫处理下,野生型拟南芥体内SAM含量与过表达株系差异不显著;随着胁迫程度的增加,SAM含量显著下降,而PvSAMS1过表达株系的SAM含量显著高于野生型。结果提示,通过SAM消耗来缓解NaCl胁迫伤害,而PvSAMS1过表达能促进SAM合成,增强了抗盐性。

上述结果表明过表达PvSAMS1基因能够提高植物的耐盐性并促进SAM的合成,而SAM是否能直接调控海滨雀稗耐盐性需要进一步证明。我们通过设置不同浓度的SAM试验发现,高浓度的SAM对海滨雀稗产生毒害作用,外源添加0.5 mmol·L-1SAM能显著促进海滨雀稗在NaCl胁迫下的生长,表现出更高的相对含水量和更低的电解质渗漏率,提示SAM能缓解细胞膜上的膜脂过氧化程度,减少细胞内溶物质的流失,保持细胞渗透势,使细胞具备在高NaCl环境中的吸水能力[28]。有研究表明外源施加SAM可以提高NaCl胁迫下黄瓜幼苗体内K+含量,降低Na+含量[29-30]。在本试验中,外源添加合适浓度的SAM显著降低海滨雀稗叶片和根系中的Na+含量,显著提高K+含量。证明SAM通过调节NaCl胁迫环境下海滨雀稗的离子平衡,降低离子毒害和氧化胁迫,提高海滨雀稗的耐盐性。