津巴布韦烟草丛顶病病原物的分子鉴定*

赵兴能，张 未，张丽芳，徐 萍，李艳琼,6，张谊寒，陈海如，莫笑晗

(1.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；2.云南省烟草农业科学研究院，云南 昆明 650021；3.云南省烟草公司文山州公司，云南 文山 663099；4.云南大学 生命科学学院，云南 昆明 650500；5.曲靖师范学院 生物资源与食品工程学院，云南 曲靖 655011；6.昆明学院 农学与生命科学学院，云南 昆明 650214)

烟草丛顶病(tobacco bushy top disease，TBTD)是一种严重危害烟草的病毒病害，该病最早于1958 年在津巴布韦北部烟区报道，随后在南非和马拉维等撒哈拉以南非洲多个地区广泛发生，造成巨大的经济损失[1-2]。早期通过对津巴布韦烟草丛顶病症状、寄主范围和传播途径等研究认为：烟草丛顶病毒(tobacco bushy top virus，TBTV)和烟草脉扭病毒(tobacco vein distorting virus，TVDV)为该病的病原物[1,3]。NDOWORA[4]对1个津巴布韦TBTV 分离物(TBTV-A2)进行了初步的分子生物学研究，分析了感病烟株的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)组成。

自1993 年以来，烟草丛顶病在中国云南烟区大面积发生，造成了严重的经济损失[5]。对中国烟草丛顶病病原复合体的分子鉴定表明：该病原复合体的组分包括幽影病毒属(Umbravirus)的TBTV 及其卫星RNA[6]以及马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)的TVDV 及其伴随RNA[7-8]。

埃塞俄比亚近年来暴发了烟草丛顶病，对当地烟叶生产造成了严重的影响。ABRAHAM 等[9]研究表明：埃塞俄比亚烟草丛顶病由1个病原复合体引起，该复合体由1个幽影病毒属成员——埃塞俄比亚烟草丛顶病毒(Ethiopian tobacco bushy top virus，ETBTV)及其卫星RNA 以及马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus，PLRV)组成。分子系统进化分析表明：ETBTV 与幽影病毒属花生丛簇病毒(groundnut rosette virus，GRV)亲缘关系最近，两者基因组全长核苷酸序列的一致性为70.7%，而与中国TBTV 基因组全长核苷酸序列的一致性仅为59.3%，故ETBTV 与TBTV 是2 种不同的病毒。

马拉维位于津巴布韦南部，烟草丛顶病对当地烤烟生产造成严重的危害[1]。UDAGAWA等[10]应用深度测序技术获得了TBTV 马拉维分离物(TBTV-MW)基因组全长核苷酸序列，其与ETBTV 基因组全长核苷酸序列一致性为87.7%，而与中国TBTV 基因组全长核苷酸序列一致性为51.6%，表明TBTV-MW 为ETBTV 的分离物(ETBTV-Malawi)。

除了TBTV-A2 复制酶基因片段(549 nt)序列(GenBank 登录号：AJ704818)被测定外，津巴布韦烟草丛顶病研究局限于病害的普通生物学特征，未完成病原物的分子鉴定工作，它与其他国家烟草丛顶病病原物之间的区别也未见报道。本研究采集了1个津巴布韦烟草丛顶病样品，开展其病原物分子鉴定。研究结果将明确津巴布韦烟草丛顶病病原复合体的组分及分类地位，明确不同国家发生的烟草丛顶病病原物之间的关系。

1 材料与方法

1.1 样品来源

津巴布韦烟草丛顶病烟株样品采集自津巴布韦哈拉雷市郊区农场，经过蚜虫连续传播接种烤烟(品种K326)，活体隔离保存于云南省烟草农业科学研究院研和试验基地。病株表现褪绿黄化、侧枝丛生和节间缩短等烟草丛顶病典型症状。

1.2 烟草丛顶病毒津巴布韦分离物基因组全长核苷酸序列分析

应用VALVERDE 等[11]的方法提取感染津巴布韦烟草丛顶病烟株中的dsRNA，总dsRNA 经过琼脂糖电泳分离后，纯化长度约为4 kbp 的烟草丛顶病毒津巴布韦分离物(TBTV-Zimbabwe)dsRNA 复制中间型。参考ATTOUI 等[12]的方法对病毒的5′和3′端进行扩增，所用特异引物根据ETBTV 基因组序列设计，分别为ZTBTVR281(5′-CCTCATTGGGTGGTGTGGTG-3′)和ZTBTVF3861 (5′-TAAGCTCGGGTGTGTGAACC-3′)；扩增产物经过切胶纯化(QIAquick Gel Extraction Kit)后，连接PMD-19T 载体(TaKaRa)，转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞(TaKaRa)；经过菌落PCR 筛选，提取重组质粒进行插入片段序列测定(Invitrogen)。根据获得的基因组两端序列设计引物ZTBTV5 (5′-GGGTTTCAACATGGCAATTCGAGCAATAAC-3′)和ZTBTV3 (5′-GGGCGCGCGGGGGTGAAATCCCGCCGCTA-3′)，然后进行病毒基因组全长序列扩增；扩增产物经过切胶纯化，插入双元载体PCB301-CH (数据未发表)中，应用基因组步移法对插入片段进行序列测定(Invitrogen)。

基因组片段序列应用DNASTAR 软件组装，获得TBTV-Zimbabwe 基因组全长序列。应用NCBI 在线分析软件ORF Finder，结合BLAST 等生物信息学分析工具对TBTV-Zimbabwe 基因组进行注释。应用DNASTAR 软件进行TBTV-Zimbabwe 与幽影病毒属其他成员基因组核苷酸序列以及基因组编码的推测蛋白质氨基酸序列对比，应用MEGA X 软件的NJ 法构建分子系统进化树，进化树节间的数值为1 000 次自展法检验的结果[13]。参加比较的病毒及其基因组序列Gen-Bank 登录号为：胡萝卜拟斑驳病毒(carrot mottle mimic virus，CMoMV，U57305)、胡萝卜斑驳病毒(carrot mottle virus，CMoV，FJ188473.1)、ETBTV(KJ918748.1)、花生丛簇病毒(groundnut rosette virus，GRV，Z69910.1)、罂粟花叶病毒(opium poppies mosaic virus，OPMV，EU151723.4)、豌豆耳突花叶病毒2 号(pea enation mosaic virus-2，PEMV-2，U03563.1)、TBTV (AF402620.2)、烟草斑驳病毒(tobacco mottle virus，TMoV，AY0072 31)、小苦荬黄斑驳病毒2 号(ixeridium yellow mo ttle virus 2，IxYMV2，KT946712.1)和ETBTVMalawi (LC494673.1)。

1.3 烟草丛顶病毒津巴布韦分离物卫星RNA 基因组全长核苷酸序列分析

提取感染津巴布韦烟草丛顶病烟株中的dsRNA，纯化长度约为0.5 kbp 的TBTV-Zimbabwe 卫星RNA 的dsRNA 复制中间型，参考已有方法[6,12]对该病毒卫星RNA 全长基因组进行扩增。扩增产物序列测定和分析方法同1.2 节。

1.4 津巴布韦烟草丛顶病样品中马铃薯卷叶病毒属成员的分子鉴定

采用Trizol 试剂(Invitrogen)提取感染津巴布韦烟草丛顶病烟株中的总RNA，以此为模板，应用黄症病毒科(Luteoviridae)的通用引物[14]，采用一步法RT-PCR (TaKaRa)对样品中可能存在的黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属成员的外壳蛋白(coat protein，CP)基因片段进行扩增。扩增产物序列测定和分析方法同1.2 节。

2 结果与分析

2.1 烟草丛顶病毒津巴布韦分离物分子鉴定

TBTV-Zimbabwe 基因组全长核苷酸序列为4 185 nt (GenBank 登录号：MW113249)。编码4个开放阅读框架(open reading frame，ORF)，其基因组结构具有幽影病毒属的典型特征[15]。ORF1(11～886 nt)编码推测的P1 蛋白与病毒复制有关；在ORF1 终止密码子(884～886 nt)上游发现开放阅读框架-1 移码信号(877～883 nt，GAATTTT)，通过在该位置的移码翻译产生ORF1-2 的翻译产物P1-2，ORF1-2 (11～2 547 nt)编码推测的病毒复制酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)；ORF3 (2 679～3 467 nt)编码的P3 蛋白为推测的病毒多功能蛋白；ORF4 (2 773～3 549 nt)编码的P4 蛋白为推测的病毒细胞间运动蛋白。TBTVZimbabwe 基因组有3个非编码区，分别是5′端非编码区(1～10 nt)、基因间非编码区(2 548～2 678 nt)和3′端非编码区(3 550～4 185 nt) (图1)。

图1 TBTV-Zimbabwe 基因组结构Fig.1 Genomic organization of TBTV-Zimbabwe

TBTV-Zimbabwe 与幽影病毒属其他成员在基因组全长核苷酸序列水平上的一致性为47.8%～94.6%，其中与ETBTV 和ETBTV-Malawi 序列的一致性最高，分别为94.6%和87.5%；与在非洲发生流行的GRV 序列一致性为71.6%；与TBTV 序列一致性仅为56.9% (表1)。根据幽影病毒属各成员基因组全长序列构建的分子系统进化树(图2a)显示：TBTV-Zimbabwe 与ETBTV 和ETBTV-Mala wi 位于一个进化分支，它们与GRV亲缘关系较近，TBTV 则与OPMV 位于另一个进化分支。

由表1 还可知：TBTV-Zimbabwe 与幽影病毒属其他成员P1 蛋白在氨基酸序列水平上的一致性为29.2%～91.1%，其中与ETBTV 和ETBTV-Malawi 的序列一致性最高，分别为91.1%和85.2%；TBTV-Zimbabwe与幽影病毒属其他成员的P1-2 蛋白在氨基酸序列水平上的一致性为49.0～95.9%，其中与ETBTV 和ETBTV-Malawi的序列一致性最高，分别为95.9%和92.0%；TBTVZimbabwe 与幽影病毒属其他成员P3 蛋白在氨基酸序列水平上的一致性为15.6%～90.1%，其中与ETBTV 和ETBTV-Malawi 的序列一致性最高，分别为90.1%和79.0%；TBTV-Zimbabwe 与幽影病毒属其他成员P4 蛋白在氨基酸序列水平上的一致性为37.7%～96.1%，其中与ETBTV 和ETBTV-Malawi 的序列一致性最高，分别为96.1%和90.3%。根据幽影病毒属成员P1、P1-2、P3 和P4 蛋白氨基酸序列分别构建的分子系统进化树(图2b～e)显 示：TBTV-Zimbabwe 与ETBTV 和ETBTV-Malawi 位于一个进化分支，TBTV 则与OPMV 位于另一个进化分支。

图2 幽影病毒属分子系统进化树Fig.2 Phylogenetic trees of umbraviruses

表1 TBTV-Zimbabwe 与幽影病毒属成员基因组序列和蛋白质氨基酸序列的一致性Tab.1 Genome sequence identities and amino acid sequence identities of the putative proteins between TBTV-Zimbabwe and other umbraviruses %

2.2 烟草丛顶病毒津巴布韦分离物卫星RNA 分子鉴定

TBTV-Zimbabwe 卫星RNA 基因组全长核苷酸序列为522 nt (GenBank 登录号：MW113250)，不编码ORF。TBTV-Zimbabwe 卫星RNA 与ETBTV 卫星RNA (GenBank 登录号：KJ918747)和TBTV 卫星RNA (GenBank 登录号：KU997687)基因组全长核苷酸序列的一致性分别为93.9%和42.9%。BLAST 分 析表 明：TBTV-Zimbabwe 卫星RNA 与GenBank 数据库中除ETBTV 卫星RNA各个分离物外的其他序列无同源性。

2.3 津巴布韦烟草丛顶病样品中马铃薯卷叶病毒的分子鉴定

应用黄症病毒科通用引物对津巴布韦烟草丛顶病样品提取的总RNA 进行RT-PCR 扩增，在津巴布韦样品中获得约550 bp 的目标片段，显示有马铃薯卷叶病毒属成员的存在。序列分析表明：该扩增片段为马铃薯卷叶病毒属马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus，PLRV)外壳蛋白的部分序列。该序列与GenBank 登录的其他PLRV 分离物在核苷酸水平上的一致性为95.3%～96.1%；其编码的病毒外壳蛋白氨基酸序列与其他PLRV分离物的一致性为94.3%～97.8%，而与TVDV 的一致性仅为58.5%。说明津巴布韦烟草丛顶病病原复合体包含PLRV。

3 讨论

根据国际病毒分类委员会(International Co mmittee on Taxonomy of Viruses，ICTV)分类报告，幽影病毒属目前有11个确定成员：CMoMV、CMoV、ETBTV、GRV、IxYMV2、莴苣小斑驳病毒(lettuce speckles mottle virus，LSMV)、OPMV、败酱草和性斑驳病毒(patrinia mild mottle virus，PMMV)、PEMV-2、TBTV 和 TmoV；该属的暂定成员有菜豆黄脉带病毒(bean yellow vein-banding virus，BYVBV)、向日葵皱缩病毒(sunflower crinkle virus，SuCV)、向日葵黄斑病毒(sunflower yellow blotch virus，SuYBV)和烟草黄脉病毒(tobacco yellow vein virus，TYVV)。幽影病毒属内种的划分原则为：天然寄主范围、dsRNA 带型、基因组核苷酸序列一致性小于70%、与代表大部分基因组的cDNA 探针不能杂交或者杂交很弱[15]。本研究表明：TBTV-Zimbabwe 具有典型的幽影病毒属成员基因组结构特征。分子系统进化分析显示：TBTV-Zimbabwe 与ETBTV 和ETBTV-Malawi 亲缘关系很近，而与TBTV 亲缘关系较远。本研究中TBTV-Zimbabwe 与另一个津巴布韦TBTV 分离物TBTVA2 复制酶基因部分序列在核苷酸水平上的一致性为94.5%，在氨基酸水平上的一致性为97.3%。根据ICTV 幽影病毒属内种的划分原则，津巴布韦烟草丛顶病病原之一的TBTV-Zimbabwe 应是ETBTV 的分离物，它与中国烟草丛顶病病原之一的TBTV 分别属于幽影病毒属内不同的病毒种。

根据ICTV 的分类报告，幽影病毒属病毒的卫星RNA 有4 种：CMoMV 卫星RNA、GRV卫星RNA、PEMV 卫星RNA 和TBTV 卫星RNA[16]。埃塞俄比亚烟草丛顶病病原复合体包含ETBTV 的卫星 RNA[9]。本研究中TBTV-Zimbabwe 卫星RNA 与ETBTV 卫星RNA 基因组全长核苷酸序列一致性为93.9%，这2个病毒卫星RNA 应归为1个种。

本研究在津巴布韦烟草丛顶病植株中检测到马铃薯卷叶病毒属的PLRV，埃塞俄比亚烟草丛顶病病原复合体中除ETBTV 及其卫星外，也含有PLRV[9]，表明PLRV 为非洲发生的烟草丛顶病病原复合体的组分之一。中国烟草丛顶病病原复合体中的马铃薯卷叶病毒属成员为烟草脉扭病毒(TVDV)[7]。中国烟草丛顶病病原复合体中包含TVDV 伴随RNA，为马铃薯卷叶病毒属伴随RNA 组成员[8]。应用马铃薯卷叶病毒属伴随RNA 组通用引物[17]对津巴布韦烟草丛顶病样品总RNA 进行RT-PCR 扩增，未扩增出目标条带。对本研究的津巴布韦烟草丛顶病样品分别应用小RNA 深度测序和转录组深度测序的方法进行测定并注释其中含有的病毒序列，也未发现马铃薯卷叶病毒属伴随RNA 组成员(数据未发表)。

4 结论

津巴布韦烟草丛顶病病原复合体的病毒组分分别为ETBTV、ETBTV 卫星RNA 和PLRV，与埃塞俄比亚烟草丛顶病病原复合体的相应组分在病毒种的分类水平上一致，但与中国烟草丛顶病病原物在分子水平上差异较大。