黑霉菌源多肽对韭菜防御性酶活性的影响

许 真 张 洋 刘宏伟

（1.鹤壁职业技术学院食品工程学院，河南 鹤壁 458030；2.鹤壁市农产品质量安全监测检验中心，河南 鹤壁 458030）

0 引言

活性肽（Active Peptide）又称生物活性肽，由2 个或2 个以上氨基酸通过肽键相连而成，分子结构不同于氨基酸和蛋白质，复杂程度不尽相同［1］。活性肽在极低的浓度条件下，即可对生物体的整个生命活动发挥有益作用或特殊的生理功能，具有较强的抗氧化、抗菌、促生长等功能，可直接被吸收利用，且吸收速度较快，也可作为载体发挥作用［2］。

植物的抗病性与其体内的防御酶系有极其密切的关系［3］。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）、 多 酚 氧 化 酶（Polyphenol Oxidase，PPO）和苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia Lyase，PAL）是植物体内重要的防御酶，通过参与清除活性氧，降低活性氧及氧自由基对细胞膜系统的伤害，促进酚类、植保素和木质素等抗病相关物质的合成，起到增强植物抗病性的作用。

近年来，人们对多种植物感病后防御酶活性的变化规律进行了深入研究［4］，但有关活性肽对植物体内防御酶活性的影响的研究较少。笔者以受病虫害严重、使用农药较多的韭菜为研究对象，叶片喷施黑霉菌源多肽，对其叶片中具有抗病性的相关酶活性进行测定，以期开发出经济、高效、毒性小、无残留的活性肽植物保护制剂，为活性肽在植物保护中的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试韭菜品种为大叶韭菜，蔬菜试验田大棚栽培。黑霉菌源多肽，鹤壁兴旺生物科技有限公司生产；愈创木酚、磷酸盐缓冲液、邻苯二酚，上海跃腾生物科技有限公司生产；双氧水（H2O2，分析纯），国药集团化学试剂有限公司生产；植物苯丙氨酸解氨酶试剂盒，上海源叶生物科技有限公司生产。

1.2 仪器与设备

UV-2000 型紫外分光光度计，上海尤尼可仪器有限公司生产；TP-114 电子分析天平，赛多利斯仪器有限公司生产；TGL-16gR 型台式离心机，上海安亭科学仪器厂生产。

1.3 试验方法

1.3.1 韭菜栽培。韭菜在大棚内盆栽。培育壮苗后，选取长势一致（高20 cm 左右）、健壮无损伤的韭菜移植于种植盆中，每盆定植3 株（每株3 棵），采取如下4 种处理：①清水处理（CK1）；②接种灰霉病菌（CK2）；③接种灰霉病菌并喷施50%多菌灵粉剂300 倍液（CT1）；④接种灰霉病菌并喷施10 mg/L 多肽溶液（CT2）。每个处理9 株，3 次平均试验。喷施程度以叶面均匀布满雾状溶液为标准。

1.3.2 防御性酶活性测定方法。参照CHEN［5］等的方法稍做修改，提取植物组织内防御酶粗酶液。称取同一叶位处的叶片1.0 g，放入预冷的研钵中，加8 mL 预冷的磷酸缓冲液在冰浴条件下研磨成浆，转移至 10 mL 离心管，4 ℃、13 000 r/min 离心 30 min，上清液即为粗酶液。采用吸光光度法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性［6］、过氧化氢酶（CAT）活性［7］、过氧化物酶（POD）活性［7］、多酚氧化酶（PPO）活性［8］，参考试剂盒说明书测定苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性。

1.4 数据分析

数据采用Origin 9.1 软件进行数据分析，利用Microsoft Excel 2007 绘制图表。

2 结果与分析

2.1 不同处理对SOD 活性的影响

病原菌侵染植物体后，最初的防御反应与活性氧（Reactive Oxygen，ROS）积累密切相关，多余的活性氧会影响植物正常的生理活动。SOD 是第一个参与活性氧清除反应的酶，处于抗氧化反应的核心地位，可将O2−转化为H2O2，H2O2是诱导植物抗病机制的激发分子［9］。

CK1处理后，韭菜叶片中SOD 活性随时间延长无明显变化，但其他3 个处理均显著提高了SOD 活性，见图1。这表明SOD 活性的变化与灰霉病菌的侵染有关。CK2处理2.0 d 后，SOD 活性达到最大值，为170.03 U/g（FW），随后酶活性快速降低；CT1处理 12 h 后，SOD 活性显著升高，1.0 d 后达到峰值 230.14 U/g（FW），是 CK1的 2.31 倍，是 CK2的 1.9 倍；CT2处理第 2.0 d，SOD 活性达到最高值232.69 U/g（FW），略高于CT1处理，随后逐渐下降，但仍高于CK1和CK2，说明活性肽和多菌灵处理都能诱导提高韭菜叶片中SOD 活性，但活性肽诱导达峰值时间较多菌灵处理晚，具体机制还有待进一步研究。

图1 黑霉菌源多肽处理对韭菜叶片中SOD 活性的影响

2.2 不同处理对CAT 活性的影响

CAT 可将 H2O2还原为水（H2O）和氧气（O2），在清除H2O2和维持H2O2正常水平中起重要作用，是植物体内重要的活性氧清除剂。由图2 可知，无菌水处理后CAT 活性无明显变化；CK2处理后，CAT 活性逐渐增强，3.0 d 达到最大值 11.90 U/（g·min）（FW）；CT1处理后，CAT 活性迅速增加，2.0 d 达到峰值22.54 U/（g·min）（FW），是 CK2的 1.89 倍，之后降低，4.0 d 时有所回升，随后降低；CT2处理后第 3.0 d，CAT 活性达到最大值 21.63 U/（g·min）（FW），是CK2的1.81 倍，比 CT1少 0.91 个活性单位，随后降低，但仍高于CK2，说明活性肽对CAT 具有积极的诱导作用。

图2 黑霉菌源多肽处理对韭菜叶片中CAT 活性的影响

2.3 不同处理对POD 活性的影响

POD 除具有清除活性氧的作用外，还能促进酚类物质的氧化和木质素的形成，可有效抑制病原菌的侵染。由图3 可知，与CK1处理相比，其他3 个处理均显著提高了叶片内POD 的活性，并在第3.0 d 分别达到最大值，CT2最高值为 92.93 U/（g·min）（FW），CT1最 高 值 为 76.63 U/（g·min）（FW），CK2最 高值为 71.68 U/（g·min）（FW），CT2最高值分别比CT1、CK2、CK1高出 1.21、1.29、1.76 倍，随后 POD活性逐渐降低，但CT2处理的酶活性仍然高于其他处理，说明活性肽对POD 的诱导力高于其他处理。

图3 黑霉菌源多肽处理对韭菜叶片中POD 活性的影响

2.4 不同处理对PPO 活性的影响

PPO 可促进细胞壁木质化，降低病原菌侵染对植物造成的损伤，是酚类物质被氧化、木质素积累、植保素合成等过程的关键性酶，在植物的防御机制中发挥着重要作用。图4 表明，韭菜叶片受到灰霉病菌侵染后，PPO 活性在第 3.0 d 最高，为 5.83 U/（g·min）（FW）；CT1处理后，PPO 活性也在第3.0 d 达到峰值，为 7.66 U/（g·min）（FW）；CT2处理在第 2.0 d 达最高值，为7.68 U/（g·min）（FW）。这说明活性肽对 PPO活性具有一定的诱导作用。

图4 黑霉菌源多肽处理对韭菜叶片中PPO 活性的影响

2.5 不同处理对PAL 活性的影响

PAL 是苯丙烷类代谢途径中的第一关键酶和限速酶，在植物抗病性酚类物质、木质素和植保素等物质的合成中发挥着重要作用。结果显示，灰霉病菌侵染导致韭菜叶片中PAL 活性显著上升，可能诱导产生更多的酚类和植保素，从而抑制灰霉病菌的生长繁殖。活性肽处理在1.0 d 和3.0 d 出现了2 个峰值，最高值为4.24 U/g（FW），高于其他处理，表明活性肽在诱导PAL 活性上具有积极作用（见图5）。

图5 黑霉菌源多肽处理对韭菜叶片中PAL 活性的影响

3 结论

笔者对活性肽诱导韭菜叶片中防御性酶活性的变化进行了初步研究，发现韭菜叶片受到灰霉病菌侵染后（CK2），叶片中的SOD、CAT、POD、PAL和PPO 活性均比无菌水（CK1）处理显著增强；施用多肽后这5 种防御性酶活性比CK2处理有不同程度升高，说明多肽与防御性酶活性诱导具有正相关性，在提高植物抗病能力上有积极作用。活性肽在生物防治真菌性病害中具有一定的应用前景，但具体诱导植物产生抗病性反应的机制有待进一步研究。