基于金纳米结构的光谱探针在传感器中的应用*

李紫滢，杨 梦，陈志雄，刘嘉丽，管 燕,胡 蓉,杨 通，杨云慧

(云南师范大学化学化工学院，云南 昆明 650500)

纳米结构是指在维度上至少有一个维度处于纳米级(1～100 nm)，或者是以纳米级的材料作为基本单元而存在的材料，金纳米结构基于其独特的性质被认为是生物医学应用的最佳选择。常见的金纳米结构有金纳米簇[1]、金纳米球[2]、金纳米棒[3]、金纳米线[4]、金纳米双锥[5]、金纳米片[6]、金纳米笼、金纳米立方体[7]、金纳米星[8]和金纳米花等。在分析化学领域，金纳米结构由于其较小的尺寸、良好的生物相容性和独特的光学性质，可作为优良的光学探针应用于生化传感和光学成像[9]等领域。其中局域表面等离子共振性质(localized surface plasmon resonance, LSPR)是金纳米结构重要的光学性质之一，当一定频率的光照射到尺寸远小于光的波长的金属纳米粒子表面时，如果入射光子频率与金属纳米粒子的表面传导电子产生的集体振荡频率相同，电子和光子在金属纳米粒子的表面的局部区域发生剧烈的共振，此现象称为LSPR性质。金属纳米粒子的LSPR性质与它自身元素成分以及形状、尺寸大小还有外界的介质微环境等因素有很大的关系。由于金纳米结构在可见或近红外区域有明显的LSPR峰，可用比色分析法来对目标物进行定量或者定性分析。目前，基于纳米结构的可视化分析策略主要集中在以下几个方面：(1)当金纳米结构处于小尺寸时，约在2 nm以内，其以纳米簇的形式存在，不具有明显的吸收特性，但金纳米簇都具有荧光性质。目前基于金纳米簇的光学分析以荧光分析为主，通过荧光猝灭的作用也可实现对靶物的可视化分析检测，例如：Yang等合成了一种赖氨酸稳定的金纳米簇和牛血清蛋白稳定的金纳米簇的混合溶液用于Cu2+的高灵敏检测，当Cu2+存在时，荧光很容易被猝灭[10]。(2)金纳米球状颗粒的团聚使得溶液颜色由红色变为蓝色，即金纳米结构间的距离比平均粒径大时，金纳米结构就处于分散的状态，此时溶液为红色；当分析物存在时，导致金纳米结构间的间距小于平均粒径时，金纳米则处于聚集状态，溶液呈现蓝色[11]。(3)针对于金纳米棒和金纳米双锥等纳米结构，因具有纵向和横向等离子体吸收的光学特性，可以通过腐蚀或者Ag+沉积的方式诱导其胶体溶液颜色发生改变，实现对分析物的可视化检测[12]，比如在金纳米结构表面沉积Ag，会导致其LSPR峰发生蓝移。基于该原理对目标物的比色分析可以在一定程度上避免金纳米结构的自团聚造成的“假阳性”的结果。(4)由于金纳米结构独特的散射特性与材料本身以及周围介质环境有密切的关系，因此，可以利用暗场散射分析法对目标物进行定性和定量的检测分析。相比于前面的比色法，暗场散射分析法可以在单个纳米粒子水平对目标进行检测分析。

基于以上的性质，金纳米结构在化学和生物传感方面得到了广泛的应用，本文综述了金纳米结构作为光学探针在生物和化学传感方面的应用，主要介绍了金纳米结构在重金属离子、食品有毒物质、肿瘤标志物、生物毒素以及核酸检测等方面的应用，并对金纳米结构未来的发展前景进行了展望。

1 在化学传感中的应用

1.1 重离子的检测

Hg2+可通过食物链在人体重要器官中积累，可引起脑损伤、肾功能衰竭等慢性疾病。对水和食品资源中的Hg2+进行高选择性、灵敏、廉价、简便的监测对环境保护和食品安全至关重要。Zohora等[13]利用肉桂叶提取物合成具有可控光学性质的金纳米颗粒对汞离子进行快速比色检测。Miyake等报道Hg2+可以与DNA的两个胸腺嘧啶(T)相互作用，形成稳定的T-Hg2+-T，具有高度选择性，这种基于DNA结构的传感器能够选择性地检测水相中的Hg2+。但是这种方法，灵敏度相对较低[14]。为了解决这个问题，2017年，Yu等[15]设计了一种用于Hg2+检测的比色/荧光双模生物传感器，使用荧光染料标记的DNA发夹进行杂交连锁反应(hybridization chain reaction,HCR)，可以极大地提高检测的灵敏度。该研究最大的特色是：通过比色法可以用肉眼直接观测测定结果，而荧光检测可以在更广的盐浓度范围内进行，对工业废水的一般环境分析和评价具有良好的潜力。

图1 超灵敏检测Hg2+的比色/荧光双模传感器的工作原理[15]

1.2 食品中有毒物质的检测

三聚氰胺是一种富含氮的化学物质，在2008年，中国发生三聚氰胺奶粉事件以后，三聚氰胺越来越受到人们的关注。传统的检测方法都需要专业的操作人员且成本较高。因此，需要寻找一种可以快速、简便、灵敏度高的检测三聚氰胺方法。Cao等[16]建立了一种检测三聚氰胺的比色法。通过将相应的金属阳离子(Au3+)与还原剂3,5-二羟基苯甲酸混合，实现了金纳米粒子在水中的一步合成，添加三聚氰胺后，3,5-二羟基苯甲酸与三聚氰胺发生强氢键相互作用。因此，金纳米颗粒的形成被三聚氰胺打断。由于没有足够的还原剂来还原Au3+离子。当三聚氰胺浓度增加时，溶液颜色会由紫色变成黄绿色。该方法可以对三聚氰胺进行简单、高效的识别和定量。根据形成的金纳米颗粒(Au NPs)的颜色变化，可以直接监测三聚氰胺的浓度。2015年，Yin报道了一种基于H2O2-Au NPs快速灵敏比色法用于检测牛奶中的三聚氰胺[17]。用过氧化氢快速还原金离子，生成准球形非聚集Au NPs，得到红色溶液。当有三聚氰胺时，H2O2可以与三聚氰胺反应，生成稳定的化合物。随着过氧化氢的消耗，Au NPs的生长速度减慢，导致Au NPs聚合形成蓝色溶液，其检测原理见图2。这种方法的可以检测低于 20 μM的三聚氰胺，检测限为0.4 μM。

图2 基于H2O2-Au NPs快速检测牛奶中三聚氰胺的示意图[17]

2017年，Chen等[18]利用海胆型金纳米作为探针，实现了简单、快速、有选择性的三聚氰胺检测。基于金纳米海胆的聚集，在pH值为5.72时对三聚氰胺进行检测，这种方法的线性范围约为0.1～1 μM,检测限为18 nM。2018年，Hu等[19]提出了一种基于适体修饰的Au NPs的比色方法，这种方法简单、选择性好、灵敏度高，适用于微量样品中三聚氰胺的检测。

2 在生物传感中的应用

2.1 肿瘤标志物的检测

人甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)已被广泛认为是一种诊断性生物标志物，可用于检测早期的人类肝细胞癌。2016年，Ma等[20]基于金纳米探针，检测AFP浓度。首先在微孔板上固定AFP抗体和AFP抗原以及过氧化氢酶标记的AFP抗体形成三明治型的免疫复合物，然后过氧化氢酶作为催化剂催化H2O2分解为H2O和O2，最后，通过Fe2+离子作为催化剂使H2O2歧化生成更活泼的自由基(·OH)。·OH与金纳米棒(Gold Nanorods, Au NRs)进行定量反应，·OH可作为氧化剂将Au(0)氧化为Au(III)，溶液颜色的变化覆盖了从400～ 760 nm的可见光范围，可以很容易地用肉眼分辨出来。溶液的最终颜色与靶蛋白的浓度密切相关。这种方法的检测范围为0～120 ng/mL，LOD为5.0 ng/mL。2017年，Ma等[21]首次将贵金属纳米颗粒的散射光用于同时检测双重肿瘤生物标志物，在三明治免疫分析的基础上，用两种双散射光色的纳米探针同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen, CEA)。该方法检测甲胎蛋白和癌胚抗原具有灵敏度高，选择性好的优点，但是线性范围较窄。2020年Jiang等[22]开发了一种基于Au@Ag@SiO2的酶联免疫吸附测定系统，通过双轮信号放大策略对前列腺特异性抗原(prostate specific antigen, PSA)进行比色/聚合酶链反应/荧光检测。Cheng等[23]报道了一种基于两种无酶等温核酸扩增方法：杂交链式反应(hybridization chain reaction, HCR)和催化发夹组装(catalyzed hairpin assembly, CHA)的DNA等离子体分析，该方法可通过肉眼检测到超低浓度的PSA。

图3 NEQ-ELISA检测人甲胎蛋白(AFP)的示意图(a)[20]；在DFM下同时测定AFP和CEA的示意图(b)[21]

外泌体是由活细胞分泌到细胞外环境中的纳米级膜囊泡，广泛存在于各种体液中。因为外泌体携带的多种蛋白质反映了亲代细胞的起源，成了癌症诊断的新兴生物标志物。2017年，Jiang等[24]报道了一种基于适体和Au NPs的简单比色方法来检测外泌体上的蛋白质。2020年，Zhang等开发了一种灵敏且易于操作的基于金纳米双锥(Au nanobipyramids, Au NBPs)的等离子体比色策略。这种等离子体比色法灵敏度高、颜色变化丰富。这种方法由两部分组成。在第一部分，外泌体引发竞争性反应，在此过程中，通过设计多个占位链产生大量碱性磷酸酶(ALPs)，有效地简化了过程并放大了信号。在第二部分中Au NBP@MnO2纳米片的刻蚀引起Au NBP@MnO2纳米片的形态变化导致金纳米粒子的LSPR带蓝移。因此，可以通过这种方法简单而灵敏地定量外泌体，此外，此方法还可以通过改变捕获序列扩展到检测其他生物分子[25]。

图4 通过Au NBP@MnO2NSs的竞争反应和蚀刻进行外泌体比色检测的原理图[25]

2.2 生物毒素的检测

赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)是由多种生长在农作物上的曲霉和青霉产生，它稳定性强，难以降解，这种毒素会引起肾脏损伤。Soh等[26]在Au NPs表面修饰OTA的适体，当有OTA存在时，OTA会与适体特异性结合，适体远离Au NPs，向体系中加入羟胺(NH2OH)会将HAuCl4还原成金单质在原始的金种上均匀地生长，此时观察到溶液颜色为红色;若体系中没有OTA存在时，有适体包裹的金纳米颗粒不均匀生长，溶液的颜色为蓝色。通过肉眼便能实现OTA的可视化分析检测，检出限为1 nmol/L。

图5 可视化检测OTA的示意图[26]

微囊藻毒素(Microcystins, MCs)是最广泛存在的蓝藻毒素，具有多种毒性作用，可导致免疫系统、泌尿系统、消化系统或生殖系统的损伤。2018年，Wei提出一种基于CdS/ZnO空心纳米棒阵列的光电流变化和Au NBPs@Ag表面等离子体共振峰的蓝移，构建了一种双模分裂型免疫传感器来检测微囊藻毒素-LR(MC-LR)。这种方法检测的线性范围为0.05～5 μg/L，对于PEC检测，检测下限为0.03 ng/L，而比色检测的检测下限为0.04 ng/L。该方法具有双模态信号读出的独特优点，实现了更灵敏、可靠的分析[27]。

图6 双模分裂型免疫传感器来检测微囊藻毒素-LR的示意图[27]

2.3 核酸的检测

MicroRNAs (miRNAs)是一种长度为19～23个核苷酸的短非编码分子，在基因表达、细胞周期、生物学发育等方面发挥着重要作用。然而，由于miRNA在血浆或血清中的序列短、序列相似度高、丰度极低(人血清中<1.0 pM)，因此miRNA的测定具有挑战性。由于金纳米粒子表面易于被修饰，在金纳米粒子与核酸分子结合后其颜色会发生明显的变化，我们可以利用这一性质对核酸分子进行检测。2017年，Gu等[28]开发了一种基于催化发夹自组装 (cascades of catalyzed hairpin assembly, CHA) 和杂交链反应 (hybridization chain reaction, HCR)扩增技术和Au@Ag纳米探针蚀刻的高灵敏度miRNA-141检测方法。这种方法对miRNA-141具有超高的敏感性，动态范围为5.0×10-17～1.0×10-11M。2019年，Zhao等[29]提出了一种基于等离子体Au@Ag “nanosnowman”形成的对miRNA高度敏感和选择性检测的新方法。由miRNA-21触发的双金属纳米粒子具有不对称的Au@Ag头-体结构，局域表面等离子体共振(LSPR)散射波长发生明显的红移，颜色由绿色变为红色。结合HCR扩增策略，该测定方法对1 fM～100 pM的miRNA-21具有良好的选择性，在暗场显微镜下具有极高的灵敏度，检测限为0.60 fM。Cai等[30]开发了一种简单且低成本的比色分析方法，使用与RNA结合的寡核苷酸作为传感探针来定量检测miRNA-148a的浓度。寡核苷酸与Au NPs通过Au-S键结合，通过结合的球核酸探针和目标RNA之间的夹心杂交反应控制Au NPs分布状态(分散/聚集)。

图7 基于CHA-HCR扩增技术和Au@Ag

3 结 语

近年来，利用金纳米结构独特的光学特性，已经开发了一系列基于金纳米结构为光学探针的化学和生物传感器。这些传感器在检测重金属离子、食品有毒物质、蛋白质、生物毒素、核酸以及生物小分子方面得到了广泛的应用，具有高灵敏度和高选择性，可以简单快速的检测目标物(见表1)。但是将这类方法用于实际检测中，还需要做出更多的努力：(1)在合成及纳米结构方面，合适的形貌和尺寸直接影响后续样品中目标靶物的准确定量分析。(2)现有的基于金纳米结构的光学分析方法灵敏度相对较低，以后的工作可以借助循环信号放大的策略进一步提高对目标物的分析灵敏度。(3)在生物检测方面，含有生物巯基化合物容易通过Au-S键与金纳米结构结合从而干扰生物分子分析的准确度，从而造成检测过程中“假阳”或“假阴”信号，带来不必要的麻烦，因此，开发捕获探针与金纳米结构更多的连接方式也是非常有必要的，如近些年来，山东师范大学唐波老师课题组开发的Au-Se键的结构方式，就有利于排除生物巯基化合物在生物成像中的干扰，因为Au-Se键的结合方式比Au-S键更稳定，从而提高了金纳米结构在生化分析中的抗干扰能力[34]。基于上述问题，研究者可以继续探索新的策略和方法来优化现有的合成方法以及金纳米结构的功能化方法以提高金纳米结构的稳定性。在金纳米结构表面修饰特定配体如抗体、核酸和肽等，来提高对目标分析物的选择性等。

表1 金纳米结构在化学和生物传感中的应用