基于EMT的芒柄花素抑制人乳腺癌MCF-7细胞迁移、侵袭及其机制的研究

贾绍华，金诗鹏，孙萌遥，丁海鑫，杨 波，叶 超

（哈尔滨商业大学 药学院（药物工程技术研究中心），黑龙江 哈尔滨 150076）

上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是胚胎发育、细胞纤维化及肿瘤转移过程中的重要环节[1]。在EMT过程中，下调E-钙黏蛋白（E-cadherin）和过量表达间波形蛋白（vimentin）能导致细胞之间的黏附性降低，细胞的运动能力增强，同时为侵袭提供了必要条件。药物可通过调节多种信号通路抑制EMT过程，进一步影响肿瘤的迁移和侵袭，从而发挥抗肿瘤作用。芒柄花素（formononetin，FMN）是从黄芪、甘草、葛根的根中分离出的异黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗菌、解痉挛等多种药理活性[2-3]。据报道，芒柄花素可抑制卵巢癌、结直肠癌、鼻咽癌等多种肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，其抗肿瘤作用可能与调控磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK-STAT）信号通路有关[4-6]。本文以肿瘤细胞转移过程EMT为切入点，在确定芒柄花素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移、黏附和侵袭能力有抑制作用的基础上，研究芒柄花素对EMT过程中E-cadherin和vimentin，以及转化生长因子β（TGF-β）信号通路的TGF-β1、基质金属蛋白激酶2/9（MMP-2/9）及MAPK信号通路的磷酸化细胞外调节激酶1/2（p-ERK1/2）、磷酸化p38蛋白（pp38）表达的影响，揭示芒柄花素抑制肿瘤迁移和侵袭的作用机制，为更好地开发和利用芒柄花素抗肿瘤作用提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ECO-170P-230 CO2培养箱（美国NBS公司）；iMark酶标仪（美国Bio-Rad公司）；CKX-41-32型倒置显微镜（日本Olympus公司）；Image Quant LAS 500凝胶成像系统（美国GE公司）。

1.2 药品与试剂

芒柄花素（批号：MUST-20041602，质量分数＞99.03 %，成都曼思特）；胎牛血清（批号：1910050，浙江天杭）；RPMI 1640溶液（批号：MA0215），CCK-8（批号：MA0218-5-aprolf，大连美仑）；牛血清白蛋白（BSA，批号：EZ2811E172，广州赛国）；纤连蛋白（FN，批号：F8180，北京索宝来）；RIPA裂解液（批号：P0013C，碧云天）；Matrigel（批号：0097011，美国BD公司）；盐酸表阿霉素（批号：17110102，哈尔滨三联药业股份有限公司）；鼠抗GAPDH抗体，鼠抗E-cadherin抗体，鼠抗p38抗体，鼠抗p-p38抗体（碧云天）；兔抗MMP-2抗体，兔抗MMP-9抗体，兔抗TGF-β1抗体（博奥森）；鼠抗vimentin抗体，鼠抗ERK抗体，鼠抗p-ERK抗体（沈阳万类）。

1.3 细胞株

人乳腺癌MCF-7细胞株，由哈尔滨商业大学药学院（药物工程技术研究中心）提供。

2 方法

2.1 CCK-8法检测芒柄花素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

取处于对数生长期的MCF-7细胞，调节细胞浓度至3×104个细胞/ml，按每孔200 μl接种于96孔板中，放入37 ℃、5 % CO2培养箱培养24 h后，给药组分别加入浓度为6，12，24，48，96 μmol/L的芒柄花素。阳性对照组加盐酸表阿霉素，阴性对照组加入等量的空白培养液。继续培养2 d。各组均设置6个重复组。48 h后，向每个孔中加入CCK-8。反应3 h后，计算细胞生长抑制率和半数抑制浓度（IC50）。抑制率（%）=[（对照孔吸光度-试验孔吸光度）/（对照孔吸光度-空白孔吸光度）]×100。

2.2 细胞划痕实验检测芒柄花素对人乳腺癌MCF-7细胞迁移能力的影响

取处于对数生长期的MCF-7细胞并调节细胞密度至6×105个细胞/ml，取1.6 ml细胞悬液接种于6孔板中，混匀，置于37 ℃、5 % CO2培养箱中培养24 h后，取出6孔板，显微镜下观察，待细胞完全贴壁后在单层细胞上划痕致伤，吸出培养液，每孔用PBS清洗2次。分为5组，阳性对照组各孔加盐酸表阿霉素溶液1.6 ml，使其终浓度为0.50 μmol/L，阴性对照组加空白培养液1.6 ml，实验组各孔分别加芒柄花素溶液1.6 ml，使其终浓度为18.75，37.50，75.00 μmol/l，拍照记录后移入培养箱，24 h后取出6孔板再次拍照，计算伤口愈合率。伤口愈合率（%）=（迁移前划痕面积-迁移后划痕面积）/迁移前划痕面积×100。

2.3 细胞黏附实验检测芒柄花素对人乳腺癌MCF-7细胞黏附能力的影响

调整细胞密度为2.5×105个细胞/ml，取1.6 ml细胞悬液接种于6孔板中，放入37 ℃、5 % CO2培养箱中培养24 h。24 h后，阳性对照组各孔加盐酸表阿霉素溶液1.6 ml，使其终浓度为0.50 μmol/L，阴性对照组加空白培养液1.6 ml，实验组各孔分别加芒柄花素溶液1.6 ml，使其终浓度为18.75，37.50，75.00 μmol/L。稀释Matrigel胶，将稀释后的Matrigel胶铺在96孔板里，每孔35 μl。置于37 ℃、5 % CO2培养箱24 h。取出6孔板，胰蛋白酶消化后离心，除去含血清的培养基，用RP1640溶液稀释，将细胞密度调整为2.5×105个细胞/ml。取96孔板，用2 % BSA封闭30 min，按每孔150 μl接种于96孔板中，置于37 ℃、5 % CO2培养箱中培养1 h，取出，用PBS轻轻洗一次，加入噻唑蓝（MTT），4 h后每孔加入DMSO，测OD值，计算黏附率。黏附率（%）=实验组吸光度/对照组吸光度×100。

2.4 细胞侵袭实验检测芒柄花素对人乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力的影响

调整细胞密度为2.5×105个细胞/ml，取1.6 ml细胞悬液接种于6孔板中，放入37 ℃、5 % CO2培养箱中培养24 h。24 h后，阳性对照组各孔加盐酸表阿霉素溶液1.6 ml，使其终浓度为0.50 μmol/L，阴性对照组加空白培养液1.6 ml，实验组各孔分别加芒柄花素溶液1.6 ml，使其终浓度为18.75，37.50，75.00 μmol/L。Matrigel胶用无酚红RPMI1640按1:6稀释，然后铺在Tranwell上室，每孔60 μl。置于37 ℃、5 % CO2培养箱培养24 h。取出Tranwell小 室，将配制好的FN均匀涂在小室下室，置于超净台中干燥30 min，再在下室加入0.1 %BSA 200 μl，置培养箱孵育30 min。取出6孔板，加胰蛋白酶消化细胞，1500 r/min离心5 min，除去含血清的培养基，用无酚红RP1640稀释，将细胞调整为2.5×105个细胞/ml，从培养箱中取出Transwell小室并置于超净台中，向下室加入含10 %胎牛血清的培养基，上室吸去培养基，并加入细胞悬浮液200 μl，置于37 ℃、5 % CO2培养箱中24 h。最后，弃去上室细胞液，将上室、下室的细胞固定染色，取棉签将上室未侵袭过去的细胞擦去，显微镜下观察、拍照，计算侵袭率。侵袭率（%）=实验组的细胞数/对照组细胞数×100。

2.5 Western Blot检测芒柄花素对TGF-β1、E-cadherin、vimentin、MMP-2、MMP-9、ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-p38蛋白表达的影响

收集经18.75 μmol/L、37.50 μmol/L和75.00 μmol/L芒柄花素作用48 h后的MCF-7细胞，经RIPA裂解液法提取细胞总蛋白。检测TGF-β1、E-cadherin、vimentin、MMP-2、MMP-9、ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-p38蛋白的表达量变化，以β-actin为内参，12 %聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至硝酸纤维素（NC）膜上，室温下脱脂奶粉封闭2 h，加入相应的一抗抗体，4 ℃孵育过夜，Tris-HCl缓冲盐溶液洗涤后加入二抗，室温孵育2 h。洗涤后增强型化学发光（ECL）显色，Image Quant LAS 500凝胶成像仪分析。

2.6 统计学处理

采用SPSS 21.0软件对实验数据进行统计学处理，各组实验数据均值采用均数±标准差表示，采用单因素方差分析比较均值，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 芒柄花素对MCF-7细胞增殖的影响

与对照组比较，随芒柄花素给药浓度的上升，对细胞增殖的抑制率逐渐增加，说明不同剂量的芒柄花素处理MCF-7细胞48 h，对MCF-7细胞的增殖有较好的抑制作用，且作用呈剂量依赖性。芒柄花素的IC50值为（74.61±0.03）μmol/L，根据IC50值确定后期给药浓度分别为18.75，37.50，75.00 μmol/L。见表1。

表1 芒柄花素对MCF-7细胞增殖的影响（n=6）

3.2 芒柄花素对MCF-7细胞迁移能力的影响

细胞迁移实验结果表明，不同浓度的芒柄花素处理MCF-7细胞48 h后，与阴性对照组比较，细胞迁移面积随芒柄花素给药剂量的增加而降低，各组的迁移率分别为：阴性对照组63.987 %±0.019 %，阳性对照组29.490 %±0.004 %，芒柄花素低剂量组56.537 %±0.008 %，中剂量组29.253 %±0.004 %，高剂量组14.880 %±0.001 %，芒柄花素各剂量给药组的MCF-7细胞迁移能力显著下降（P＜0.01），且作用呈剂量依赖性，提示芒柄花素具有抑制MCF-7细胞迁移的作用。见图1。

图1 芒柄花素对MCF-7细胞迁移的影响（4×10）

3.3 芒柄花素对MCF-7细胞黏附能力的影响

细胞黏附实验结果表明，不同浓度的芒柄花素处理MCF-7细胞48 h后，与阴性对照组相比，细胞黏附率随给药剂量的增加而下降，各组的黏附率分别为：阳性对照组60.251 %±0.054 %、芒柄花素低剂量组99.320 %±0.130 %、中剂量组59.370 %±0.118 %、高剂量组34.443 %±0.038 %。芒柄花素中剂量和高剂量给药组的MCF-7细胞黏附能力显著下降（P＜0.01），且作用呈剂量依赖性，提示芒柄花素具有抑制MCF-7细胞黏附的作用。见表2。

表2 芒柄花素对人乳腺癌MCF-7细胞黏附能力的影响（n=3）

3.4 芒柄花素对MCF-7细胞侵袭能力的影响

细胞侵袭实验的结果表明，不同浓度的芒柄花素处理MCF-7细胞48 h后，各组的侵袭率分别为：阳性对照组21.250 %±0.007 %，芒柄花素低剂量组47.458 %±0.006 %，中剂量组35.156 %±0.017 %，高剂量组14.881 %±0.001 %，细胞侵袭率随芒柄花素给药浓度的上升而下降（P＜0.01），且作用呈剂量依赖性，提示芒柄花素有抑制MCF-7细胞侵袭的作用。见图2。

图2 芒柄花素对MCF-7细胞迁移能力的影响（10×10）

3.5 芒柄花素对MCF-7细胞TGF-β1、E-cadherin、vimentin、MMP-2、MMP-9、ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-p38蛋白表达的影响

Western Blot结果表明，与对照组相比，随着芒柄花素给药剂量的增加，E-cadherin蛋白的表达量显著上升，TGF-β1、vimentin、MMP-2、MMP-9、p-p38、p-ERK蛋白表达量下降，表明芒柄花素可上调E-cadherin蛋白表达，下调vimentin蛋白及TGF-β信号通路的TGF-β1、MMP-2、MMP-9表达和MAPK信号通路的p-ERK1/2、p-p38的表达水平，提示芒柄花素可能通过影响EMT相关蛋白的表达抑制MCF-7细胞的侵袭、迁移和黏附能力。见图3。

图3 芒柄花素对MCF-7细胞TGF-β1、E-cadherin、vimentin、MMP-2、MMP-9、ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-p38蛋白表达的影响

4 讨论

E-cadherin是钙黏素家族中一个重要的细胞黏附因子，正常情况下E-cadherin的细胞质区结构域与一些链蛋白结合，这些链蛋白可连E-cadherin和肌动蛋白的骨架，当这些链蛋白发生突变或缺失的时候，就会导致其黏附性下降，进而促进肿瘤细胞的转移和侵袭，因此E-cadherin被认为是一种“侵袭抑制因子”[7]。Vimentin是细胞间丝蛋白家族成员，能构成细胞骨架，还被认为是EMT过程中的重要组成部分，vimentin表达的上调也与肿瘤的迁移、侵袭和转移关系密切[8]。TGF-β是一种与恶性肿瘤相关的细胞因子，在肿瘤发生的早期TGF-β能诱导肿瘤细胞发生凋亡，但在晚期阶段能促进EMT进程，促进肿瘤迁移、黏附和侵袭[9]。本研究结果显示，随着芒柄花素给药剂量的上升，E-cadherin的表达升高，vimentin、TGF-β的表达降低，提示芒柄花素对人乳腺癌MCF-7的转移和侵袭有抑制作用。

癌细胞转移过程中的一个重要步骤是通过蛋白酶，如MMP对细胞外基质（ECM）的降解。MMP是一个含锌内肽酶家族，其中MMP-2和MMP-9在侵袭性乳腺癌中高表达，并与临床预后较差有关，抑制MMP-2和MMP-9的表达是预防肿瘤转移的关键步骤[10]。本研究结果表明，芒柄花素可呈剂量依赖性降低MMP-2和MMP-9蛋白的表达，提示芒柄花素可通过降低MMP-2和MMP-9的表达来抑制MCF-7细胞的侵袭转移。

MAPK通路是肿瘤转移、侵袭信号转导途径中研究最多的激酶通路，其中p38通路、ERK通路是两条重要的通路[11-12]，且MAPK通路中内源性p38的活性与乳腺癌细胞的转移和侵袭密切相关。ERK1/2是肿瘤形成的一个重要蛋白，p-ERK1/2参与肿瘤细胞的转移和侵袭[13-14]。p-ERK1/2异常活化与乳腺癌转移和侵袭有关，其可能通过促进血管生成及降解基底膜发挥促进乳腺癌进展的作用。本研究结果显示，芒柄花素可通过抑制MAPK信号通路的p-ERK1/2、p-p38的表达，协同抑制肿瘤的迁移、黏附和侵袭。

综上，芒柄花素可通过抑制EMT过程及TGF-β通路和MAPK通路中相关蛋白的表达来抑制人乳腺癌MCF-7细胞的迁移、侵袭过程，但其作用机制尚不清晰，仍需进一步的深入研究。