小儿消积止咳口服液抗肠炎靶点与作用机制研究

罗倩微，姚 璐，杨 倬，姚景春，孙成宏，张贵民*，曾克武*

小儿消积止咳口服液抗肠炎靶点与作用机制研究

罗倩微1，姚 璐1，杨 倬1，姚景春2，孙成宏2，张贵民2*，曾克武1*

1. 北京大学药学院 天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 100191 2. 鲁南制药集团股份有限公司 中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006

探索小儿消积止咳口服液改善肠道炎症作用的直接靶点，从炎症靶点生物学功能的角度，阐释小儿消积止咳口服液保护肠道并发挥消积功效的作用机制。基于靶点“钩钓”策略从脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠肠道组织中捕获并通过高分辨质谱鉴定小儿消积止咳口服液提取物的直接作用靶点蛋白，基于京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析靶点蛋白相关信号通路。通过qRT-PCR、免疫组化等方法进行靶点蛋白的功能验证。累计从肠道组织鉴定到1333个结合蛋白，并通过KEGG分析发现靶点蛋白群主要与肠道动力学、肠道免疫、黏膜屏障等功能有关。进而利用免疫组化、qRT-PCR等方法确证了小儿消积止咳口服液具有上述保护肠道功能的潜在作用。小儿消积止咳口服液具有改善小鼠肠道组织炎症损伤的作用，其作用机制可能与增强肠道动力、改善肠道免疫微环境以及维持肠道黏膜完整性有关。

小儿消积止咳口服液；肠炎；靶点鉴定；肠道动力；免疫微环境

肠炎是一种常发生于大肠和小肠的消化系统疾病，通常由细菌、病毒等微生物感染所致[1]，也可以由寄生虫感染、摄入化学毒物或药物引起。肠炎一般表现为食欲下降、恶心呕吐、腹部绞痛等，会导致营养吸收障碍、消化不良、排便异常等，严重者可能会发生肠道出血、肠穿孔甚至癌变，影响到患者的正常生活[2]。小儿消积止咳口服液临床上主要用于治疗小儿积食咳嗽[3-4]，组方中含山楂、枇杷叶、枳实、连翘、桔梗等多种苦寒中药，改善积食和通便的效果良好。方中枇杷叶具有清肺止咳、降逆止呕的功效，现代研究表明其有抗炎祛痰、抗氧化、止呕等药理活性[5]。枳实、莱菔子能用于泻痢后重、大便不通等证，研究表明枳实有促进肠胃蠕动，保护胃肠屏障，抑制炎症加重的作用[6]。连翘、桔梗有良好的抗炎与抗菌活性[7-8]，因此小儿消积止咳口服液常与抗生素联用于微生物感染诱发的儿童胃肠道炎性疾病治疗[9]。但是小儿消积止咳口服液抗肠炎的作用机制尚不清楚。本研究通过建立脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠肠道炎症模型，并结合中药成分靶点“钩钓”策略，对小儿消积止咳口服液调节肠道功能及潜在靶点蛋白进行了系统研究，进而基于靶点的生物学功能探讨了小儿消积止咳口服液改善肠道功能的作用机制。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性BALB/c小鼠32只，8周龄，体质量20～22 g，购自北京大学医学部实验动物中心，许可证号SYXK（京）2016-0041。小鼠于动物房（保持12 h光照、12 h黑暗循环，恒温25 ℃）适应性饲养7 d，自由进食饮水。动物实验经北京大学生物医学伦理会批准（批准号LA2020475）。

1.2 药品与试剂

1.3 仪器

FDU-1100型冷冻干燥机（日本EYALA公司）；FastPrep-245G型组织匀浆机（美国MP Biomedicals公司）；5424R型台式冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；800TS型多功能酶标仪（美国BioTek公司）；Orbitrap Velos Pro二维纳升高效液相色谱仪串联线性离子阱质谱（nano-HPLC-LTQ-Orbitrap/MS，美国Thermo Fisher Scientific公司）；101-1BS型烤箱（邦西仪器科技公司）；SK-R1807-E型摇床（美国Scilogex公司）；Nikon Ci-S型倒置显微镜、Nikon DS-U3型成像系统（日本尼康公司）；Mx3005P型qRT-PCR仪（安捷伦科技有限公司）。

2 方法

2.1 药物的配制

小儿消积止咳口服液冻干，得到小儿消积止咳口服液总提取物，于4 ℃的干燥环境下保存备用。称取1 g小儿消积止咳口服液总提取物，加入50 mL纯净水溶解，配成20 mg/mL的母液；取10 mL母液，用30 mL纯净水稀释成5 mg/mL药液备用。

2.2 LPS的配制

精密称取2 mg的LPS粉末，溶解于10 mL纯净水配制成0.2 mg/mL的LPS溶液，用0.22 μm滤膜滤过备用。

2.3 小儿消积止咳口服液提取物微球芯片的制备

将FeCl3溶于乙二醇，同时加入乙酸钠和柠檬酸钠，溶解后200 ℃反应9 h，合成空白磁性微球。通过与二巯基丁二酸于50 ℃恒温孵育，使其表面修饰巯基后，加入-赖氨酸三异氰酸酯将已修饰巯基的磁性微球与二苯甲酮连接，即完成表面化学物的修饰。取磁性微球5 mg分散于20 mL甲醇溶液，准确称量5 mg小儿消积止咳口服液提取物溶解于上述体系，将反应体系置于反应器中，通氮气30 min，紫外照射1 h后，用PBS溶液清洗得到键合小儿消积止咳口服液提取物的磁性微球，备用[10]。

2.4 造模、分组及给药

32只雄性BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组和小儿消积止咳口服液提取物低、高剂量（50、200 mg/kg）组，每组8只。各给药组ig 200 μL相应药物，对照组ig 200 μL生理盐水，1次/d，连续5 d；除对照组外，其余各组小鼠在末次给药时ip 200 μL LPS，建立小鼠肠炎模型，对照组ip 200 μL生理盐水，饲养12 h。按表1对各组小鼠的状态进行评分后，小鼠麻醉处死，解剖并完整取出肠组织，用生理盐水清洗后置于冰上留用。

表1 小鼠状态评分量表

Table 1 State rating scale of mice

体表表征分值表现 眼鼻0眼鼻正常、干净 1上睑下垂，无分泌物 2上睑下垂，有分泌物 被毛0光滑 1竖毛 2脱毛 粪便0粪便颗粒正常 1粪便变黑 2腹泻 肛门0正常 1肛门外翻 2排便困难 精神状态0活泼 1精神萎靡，反应迟钝 2双目无神、嗜睡 行为情况0行为敏捷 1活动减少，行为呆滞 2易蜷缩扎堆

2.5 基于微球芯片的靶点蛋白捕获

各组小鼠肠组织加入裂解液，将肠组织蛋白裂解液分为9份，设置空白组、结合组和竞争组，每组3个重复。空白组加入未键合药物成分的空白磁性微球；结合组加入键合小儿消积止咳口服液提取物的磁性微球；竞争组先将组织裂解液与10 mg/mL小儿消积止咳口服液提取物于4 ℃孵育1 h，再加入键合小儿消积止咳口服液提取液的磁性微球，4 ℃孵育8 h，用0.5%十二烷基硫酸钠溶液洗脱杂蛋白，进行后续实验。

2.6 靶点蛋白的高分辨质谱鉴定

利用nano-HPLC-LTQ-Orbitrap/MS鉴定捕获的蛋白。将各组磁性微球捕获的蛋白用胰酶消化后，经0.22 μm微孔滤膜滤过并进样分析。色谱条件：流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%乙腈水溶液（B）；洗脱条件为：0～70 min，2%～40% B；70～75 min，40%～95% B。串联质谱采用线性离子肼静电场轨道肼质谱仪（LTQ-Orbitrap Velos Pro），一级质谱采用Orbitrap检测，分辨率/400处为60 000；采集质量范围为350～2000/，依次选取一级质谱中离子强度最强的15个离子进行CID二级串联质谱分析。

2.7 基于京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）的靶点蛋白生物学功能研究

基于质谱检测结果，筛选出（结合组质谱强度－空白组质谱强度）与（竞争组质谱强度－空白组质谱强度）比值大于2的蛋白。将筛选得到的差异蛋白输入Cytoscape软件，应用其中的ClueGO进行KEGG分析，种属设置为小鼠，阈值为＜0.05，其余均采用默认参数。

一个有经验的小儿骨科医生，对于典型的生长痛，通常不需要过多的辅助检查，仅通过详细地询问病史和仔细的查体就能确诊，倒是经常有家长面对这样的诊断抱以怀疑态度，甚至要求医生给患儿开具X线检查。这种既能满足家属要求，又能为医院创收的检查，各位父母琢磨琢磨做医生的是满足呢还是满足呢还是满足呢？

2.8 免疫组化及苏木素-伊红（HE）染色分析

各组小鼠肠组织置于4%多聚甲醛中固定并制成蜡块备用。按照试剂盒说明书分别制备TNF-α、IL-6、Occludin、Claudin-1、C-kit、HSP60的免疫组化切片和HE染色切片，采用Nikon DS-U3型成像系统扫描成像，并用NDP.view 2软件进行分析。

2.9 统计学分析

实验数据采用SPSS 21.0中的ANOVA进行单因素方差分析，结果以表示。

3 结果

3.1 小儿消积止咳口服液缓解LPS诱导的小鼠肠炎病理状态

如表2所示，LPS诱导后的小鼠状态明显变差，存在竖毛、蜷缩、排便困难等病理特征；各给药组小鼠毛发光滑，整体更活泼，解剖发现各给药组小鼠肠组织水肿症状也有改善（图1-A）。HE染色结果（图1-B）显示，LPS诱导后的小鼠肠道结构被破坏，肠黏膜及黏膜下层有明显的炎症细胞浸润；各给药组小鼠肠道炎症细胞浸润明显减少，尤其高剂量组的肠道完整性和炎症程度与对照组相近。

表2 各组小鼠状态评分(, n = 8)

Table 2 State score of mice in each group(, n = 8)

组别剂量/(mg·kg−1)评分 对照80.4±0.2 模型86.0±0.8### 小儿消积止咳口服液504.6±0.7 2003.0±0.7*

与对照组比较：P＜0.001；与模型组比较：P＜0.05

P 0.01control group;P 0.05s model group

A-各组小鼠肠组织外观 B-各组小鼠肠组织HE染色

3.2 小儿消积止咳口服液提取物的肠道组织靶点鉴定

基于键合小儿消积止咳口服液的磁性微球从LPS诱导的小鼠肠道组织捕获靶点，通过高分辨质谱对靶点蛋白进行鉴定（图2-A），累计发现了1333个潜在结合蛋白（图2-B）。按照（结合组质谱强度－空白组质谱强度）与（竞争组质谱强度－空白组质谱强度）的比值大于2，（结合组质谱强度－空白组质谱强度）与（竞争组质谱强度－空白组质谱强度）进行组内检验，设置≤0.05的条件，筛选得到20个与小儿消积止咳口服液药理作用直接相关的靶点蛋白（图2-C）。基于KEGG分析结果，对这20个靶点蛋白功能进行说明。

A-靶点“钩钓”流程示意图 B-靶蛋白火山图 C-特异性磁珠结合蛋白

在所发现的潜在靶点类群中，首先重点关注了5个与肠道动力学有关的靶点蛋白，分别是EH结构域蛋白2（EH domain-containing protein 2，Ehd2）、超长链特异性酰基辅酶A脱氢酶（very long-chain specific acyl-CoA dehydrogenase，Acadvl）、核心组蛋白macro-H2A.1（core histone macro-H2A.1，Macroh2a1）、39S核糖体蛋白L40（39S ribosomal protein L40，Mrpl40）和肽基-tRNA水解酶2（peptidyl-tRNA hydrolase 2，Ptrh2）。研究表明，Ehd2能够促进细胞内三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的交换，维持肠道肌群的正常蠕动[11]。Acadvl缺乏会导致线粒体呼吸链功能降低，活性氧水平升高，肠道供能不足。Macroh2al缺失会使线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）表达显著降低[12]。Mrpl40的缺乏则会导致线粒体钙失调，从而影响线粒体功能及ATP的合成[13]。Ptrh2的突变可能导致肌肉无力。因此推测小儿消积止咳口服液提取物可能通过靶向调控多个肠道动力学相关蛋白，增强肠道细胞中的线粒体功能，进而为肠道组织细胞提供能量，发挥促进肠道蠕动的作用。

此外，还注意到6个与肠道炎症和免疫功能有关的靶点蛋白，分别是ATP依赖性RNA解旋酶DDX1（ATP-dependent RNA helicase DDX1，Ddx1）、色氨酸-tRNA合成酶1（tryptophan-tRNA ligase，Wars1）、恶性脑肿瘤缺失蛋白1（deleted in malignant brain tumors 1 protein，Dmbt1）、异源核糖核蛋白L（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L，Hnrnpl）、富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪接因子（splicing factor, proline- and glutamine-rich，Sfpq）和无POU域八聚体结合蛋白（non-POU domain-containing octamer-binding protein，Nono）。Ddxl是含TIR结构域的接头分子1（TIR-domain-containing molecule 1，TICAM1）复合物的组成部分，研究发现该酶活化导致细胞因子的释放和免疫细胞的活化，从而增加结肠炎的患病几率[14]。Wars1可以显著激活髓系细胞触发受体-1，从而诱导炎症反应[15]。研究表明，Dmbt1在炎症性肠道疾病中含量很高，表明其与肠道炎症有着密切关系[16]。Hnrnpl可与linc1992特异性结合，并形成功能性的linc1992-hnRNPL复合物，增加TNF-α的转录并促进炎症发生[17]。Sfpq可以抑制机体的氧化应激，减少炎症因子的生成。Nono可以被募集到IL-6启动子区域的PRDM1结合位点，从而对IL-6的表达起到抑制作用[18]。因此，小儿消积止咳口服液可能通过调控多种与炎症和免疫相关的靶点蛋白，调控肠道炎症与免疫功能。

另外，5个与代谢功能相关的靶点蛋白也值得关注：尿苷磷酸化酶（uridinephosphorylase，UDP）- 葡萄糖-4-差向异构酶（UDP-glucose 4-epimerase，GalE）、醌氧化还原酶（quinone oxidoreductase，mitochondrial，SQOR）、Cand蛋白1（Cullin-associated NEDD8-dissociated protein 1，Cand1）、1-酰基--甘油-3-磷酸酰基转移酶α（1-acyl--glycerol-3-phosphate acyltransferase alpha，Agpat1）和短链特异性酰基辅酶A脱氢酶（short-chain specific acyl-CoA dehydrogenase，Acads）。其中，GalE能够催化UDP-葡萄糖向UDP-半乳糖以及UDP--乙酰氨基葡萄糖向UDP--乙酰半乳糖胺的转化，有助于膳食中半乳糖的分解代谢。SQOR也可以作用于肠Cajal间质细胞，产生传导电兴奋，进而激活肠道运动。有研究报道，CAND1可以通过调控去泛素化机制进而抑制脂肪形成，而脂肪对于调控肠道炎症水平至关重要[19]。Agpat1既可以促进肠道对脂质的代谢，同时也能调节血浆葡萄糖水平[20]。Acads可以降低实验动物对油脂食物的偏好，进而降低油脂食物的摄入，减轻肠胃负担[21]。因此推测，小儿消积止咳口服液提取物可能通过靶向这些蛋白，维持了肠道细胞的正常代谢。

最后，还发现了4个与肠道细胞凋亡相关的靶点蛋白，分别是真核起始因子4A-I（Eukaryotic initiation factor 4A-I，Eif4a1）、U4/U6.U5 tri-snRNP相关蛋白2（U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 2，Usp39）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）/ATP转运酶2（ADP/ATP translocase 2，Slc25a5）和氨酰tRNA合成酶复合作用多功能蛋白2（aminoacyl tRNA synthase complex-interacting multifunctional protein 2，Aimp2）。其中，Eif4a1可以调节肠壁细胞的新陈代谢，对于肠道的自体修复具有潜在意义。而Usp39作为一种去泛素化酶，可以提高细胞周期检测点激酶2（cell cycle checkpoint kinase 2，CHK2）的稳定性，进而抑制细胞凋亡。有研究表明，Slc25a5通过磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路促进细胞的生长，并抑制细胞凋亡[22]。Aimp2可以调节Wnt/β-catenin信号传导，维持肠道干细胞的稳定增殖，进而加快肠道细胞生长[23]。由此推测小儿消积止咳口服液提取物可能通过靶向多个与肠道上皮细胞凋亡相关的靶点，抑制肠道上皮细胞凋亡。

综上可以推测，小儿消积止咳口服液提取物可能通过靶向多种不同功能的靶点蛋白群，包括促进肠道蠕动、调控肠道炎症与免疫功能、维持肠道细胞的正常代谢以及抑制肠道上皮细胞凋亡，最终发挥改善肠道病理状态的作用。

3.3 小儿消积止咳口服液促进肠道动力学标志蛋白表达

Cajal间质细胞在维持胃肠动力中发挥重要作用，而C-kit是一种酪氨酸蛋白激酶受体，在Cajal间质细胞中广泛表达[24]。免疫组化结果显示，模型组肠组织C-kit表达与对照组相比明显降低；与模型组相比，各给药组肠组织C-kit表达有明显增加（图3-A）。鉴于肠道动力和肠道细胞的线粒体能量代谢关系密切，而HSP60可作为评价细胞线粒体功能状态的标志物[25]。免疫组化结果显示，模型组与对照组相比HSP60表达明显减少，各给药组与模型组相比HSP60表达增加（图3-B），提示小儿消积止咳口服液能够保护线粒体及其功能。此外，柠檬酸合酶（citrate synthase，CS）和ATP合酶b（ATP synthase b subunit，ATPb）是线粒体合成中的2种关键酶，利用qRT-PCR检测其mRNA表达量发现，模型组肠组织和mRNA表达量明显减少（＜0.05、0.01），给药组后上述2个指标mRNA表达量显著回升（＜0.05、0.01，图3-C、D）。表明小儿消积止咳口服液能够有效促进Cajal间质细胞的增殖，同时促进肠道细胞线粒体中ATP的合成并加强能量代谢，进而维持小肠正常运动功能。

3.4 小儿消积止咳口服液改善肠道炎症微环境及黏膜屏障

炎症因子的过度表达是肠道炎症损伤的关键病理指标。如图4-A、B所示，TNF-α和IL-6在正常肠道组织中几乎没有表达，而在模型组中两者水平有明显升高；与模型组相比，给予小儿消积止咳口服液后的肠道组织中TNF-α和IL-6表达明显减少，说明小儿消积止咳口服液具有显著抑制肠道炎症的作用。

炎症因子的异常表达常会导致肠道黏膜的破坏和肠壁的损伤，而Claudin-1和Occludin是评价肠道细胞致密性的重要指标。如图4-C、D所示，对照组肠道组织中Claudin-1和Occludin均有表达，且对照组细胞完整，细胞致密性好；与对照组相比，模型组Claudin-1和Occludin表达明显减少，细胞间隙增大；而给予小儿消积止咳口服液后的肠道组织损伤有所减轻，Claudin-1和Occludin的表达也明显增加。推测小儿消积止咳口服液可以有效抑制肠道炎症反应，进而保护肠道内皮细胞，维持肠组织黏膜的致密性与完整性。

A～D-各组小鼠肠组织C-kit (A) 和HSP60 (B) 蛋白表达和CS (C) 和ATPb (D) mRNA表达 与对照组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01

图4 小儿消积止咳口服液增加小鼠肠道炎症组织TNF-α(A)、IL-6(B)、Occludin(C)和Claudin-1(D)蛋白表达

4 讨论

Cajal间质细胞是一种胃肠起搏细胞，遍布整个肠道，主要参与胃肠基本电节律调控和神经递质信号传导，与胃肠运动关系密切[26]。C-kit是其特异性标志物，几乎所有的Cajal间质细胞都会表达C-kit，因此可以通过标记C-kit来识别小肠间质细胞[27]。本研究发现，小儿消积止咳口服液可以显著增加小鼠肠道中C-kit的表达，表明小儿消积止咳口服液可能通过促进Cajal间质细胞增殖，增强小鼠肠道动力，提高小鼠肠道的传输功能。HSP60是在线粒体中稳定表达的一种蛋白，HSP60缺失可能导致细胞线粒体碎片化，因此通过检测HSP60的表达可以判断肠组织中能量合成情况。ATP可以为肠道活动提供充足的能量，CS和ATPb参与ATP的生成，是影响肠道动力的重要能量代谢相关的酶，因此提高二者的表达，对于增强肠道动力具有重要意义。研究发现小儿消积止咳口服液能够提高小鼠肠组织中HSP60的表达以及CS和ATPb的活性，提示小儿消积止咳口服液可能通过保护线粒体完整，进而增强了小鼠肠道组织的能量代谢。此外，肠黏膜对稳定肠道内环境有重要作用，肠道上皮细胞紧密连接对维持肠黏膜屏障具有重要意义。而小儿消积止咳口服液能够通过提高Claudin-1和Occludin的表达，从而发挥维持肠组织黏膜的致密性和完整性的作用。

综上所述，小儿消积止咳口服液能够有效改善LPS诱导的小鼠肠炎，其作用机制可能与增强肠道动力、改善肠道免疫微环境以及维持肠道黏膜完整性有关。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Anti-enteritis targets and mechanism of Xiaoer Xiaoji Zhike Oral Liquid

LUO Qian-wei1, YAO Lu1, YANG Zhuo1, YAO Jing-chun2, SUN Cheng-hong2, ZHANG Gui-min2, ZENG Ke-wu1

1. State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100191, China 2. State Key Laboratory of Generic Manufacture Technology of Chinese Traditional Medicine, Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276006, China

To explore the direct targets of Xiaoer Xiaoji Zhike Oral Liquid (小儿消积止咳口服液, XXZL) in improving intestinal inflammation, and explain the mechanism of XXZL on protecting the intestinal tract and exerting the effect of eliminating accumulation through the biological function of inflammatory targets.The target proteins from intestinal tissues of lipopolysaccharide (LPS)-induced mice were captured by “target fishing” strategy, and identified by high resolution mass spectrometry, followed by signaling pathway analysis based on Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG). The functions of target proteins were verified by qRT-PCR and immunohistochemistry assays.A total of 1333 binding proteins were identified, and these target proteins were mainly related to intestinal dynamics, intestinal immunity and mucosal barrier. Moreover, the immunohistochemistry and qRT-PCR assays confirmed the potential effects of XXZL on intestinal protection.XXZL can ameliorate LPS-induced intestinal tissue inflammation in mice, via enhancing intestinal motility, improving intestinal immune microenvironment and maintaining the integrity of intestinal mucosa.

Xiaoer Xiaoji Zhike Oral Liquid; enteritis; target identification; intestinal dynamics; immune microenvironment

R285.5

A

0253 - 2670(2022)08 - 2368 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.013

2021-12-17

国家自然科学基金资助项目（81973505）；国家重点研发计划基金资助项目（2019YFC170892，2019YFC1711000）

罗倩微（1999—），女，硕士，研究方向为药理学。Tel: 18811089606 E-mail: luoqianwei423@163.com

曾克武，研究员，研究方向为天然产物与中药化学生物学。Tel: (010)82801404 E-mail: ZKW@bjmu.edu.cn

张贵民，研究员，从事药物研发工作。E-mail: lunanzhangguimin@yeah.net

[责任编辑 李亚楠]