续苓健骨颗粒治疗肾虚血瘀型绝经后骨质疏松症的疗效及转录机制研究

谢丽华 柴昊 叶云金 李生强 黄景文 陈娟 陈玄 陈赛楠 葛继荣*

1.福建省中医药科学院骨质疏松证候基因组学研究室，福建 福州 350003 2.福建中医药大学，福建 福州 350122

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMOP)与遗传、内分泌、免疫等方面密切相关。中医认为中老年女性多虚多瘀[1]，有学者[2]基于“因虚致瘀”理论，提出虚、瘀是PMOP辨证的出发点。本课题组前期研究[3]也发现，肾虚血瘀证型在临床中占比相对较高。续苓健骨方是本课题组用于治疗PMOP的经验方，主治肾虚血瘀证的PMOP。为评价该方治疗PMOP的疗效和安全性，课题组对PMOP患者进行了临床研究，并用转录组测序技术探讨了其作用机制。

1 材料和方法

1.1 资料

1.1.1研究对象：选取2018年7月至2020年9月在福建省中医药科学院就诊的肾虚血瘀型PMOP患者，按随机数表法分为试验组(35例)及对照组(32例)。由于病人脱落，最后共完成54例，其中试验组27例，对照组27例。选取6例试验组患者，另选取6例骨密度正常者为健康组用于转录组测序。本研究获得福建省中医药科学院伦理委员会批准实施(20180423)。

1.1.2诊断标准：①西医诊断标准：参照《中国人骨质疏松症建议诊断标准(第三稿)》[4]；②中医辨证标准：按照《中医药防治原发性骨质疏松症专家共识(2015)》[1]。

1.1.3纳入标准：①符合西医诊断标准和中医辨证者；②年龄在50～70岁之间的自然绝经者；③自愿参加试验，签署知情同意书者。

1.1.4排除标准：①患有影响骨代谢疾病等继发性骨质疏松症者；②合并有肿瘤和造血系统等严重原发性疾病者；③肝、肾功能异常者；④近三个月内采用激素替代治疗和服用降钙素，近六个月内有连续15 d应用双膦酸盐者。

1.1.5脱落标准：失访未能按时服药者；因主观原因或出现不良事件主动退出者。

1.2 方法

1.2.1治疗药物：续苓健骨颗粒(专利号：ZL201 510 784 227.4)由骨碎补、续断、红花等12味中药组成，委托福建中医药大学附属第二人民医院制剂室生产、包装。葡萄糖酸钙片(国药准字H23020998)、骨化三醇(罗盖全，国药准字J20150011)。

1.2.2治疗方法：基础治疗：两组均给予葡萄糖酸钙片，规格为0.5 g/片，1 g/次，3次/d。试验组：另给予续苓健骨颗粒，规格为15 g/袋，1袋/次，3次/d。对照组：另给予骨化三醇，规格为0.25 μg /粒，1粒/次，2次/d。疗程均为6个月。

1.2.3疗效指标：(1)中医证候疗效：中医证候评分参照《中药新药临床研究指导原则》中的证候分级量化。分别记录治疗前、治疗后3个月及6个月的中医证候评分。(2)骨密度检测：运用美国Discovery W型DXA仪(CV=0.245 %)检测受试者治疗前、治疗后6个月的腰椎(L1～4)、左侧股骨颈及股骨近端的骨密度(bone mineral density, BMD)。

1.2.4安全性指标：进行一般体格检查，包括血、尿常规、心电图、肝肾功能检查。

1.2.5转录组测序及数据处理：抽取空腹患者外周血5 mL，提取细胞总RNA，构建cDNA文库。质控合格后在高通量测序仪上机测序，得到原始测序序列，并与参考基因组进行比对。计算出每个基因在各个样本中的表达量。将P< 0.05、两组样品log2FoldChange大于1的基因作为差异表达基因，进一步进行KEGG分析。

1.3 统计学处理

2 结果

治疗过程中试验组脱落8例，其中3例拒绝服药，2例因胃肠不耐受脱落，3例主动退出；对照组脱落5例，其中3例拒绝服药，2例因胃肠不耐受脱落。治疗前两组年龄、绝经年龄、身高、体重组间比较差异无统计学意义(P?0.05)。两组治疗前后血压、尿常规、心电图等无异常改变。试验组有3例出现肝、肾功能异常，对照组有2例出现肝、肾功能异常。经随访观察，均排除肝肾功异常与本次服药相关。

2.1 中医疗效比较

2.1.1中医证候疗效及积分比较：中医证候疗效试验组显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。两组治疗3个月、6个月后中医证候积分较治疗前均显著下降(P<0.01)，见表2。

表1 两组中医证候疗效比较

表2 两组患者治疗前后中医证候积分比较[M(P25,P75)]

2.1.2中医临床症状比较：治疗前试验组与对照组比较：下肢痿软、耳鸣组间比较差异有统计学意义，试验组评分高于对照组(P<0.05)，其余组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗3、6个月后，试验组腰脊疼痛、下肢痿软、步履艰难、耳鸣评分较治疗前显著下降(P<0.05或P<0.01)；对照组治疗3个月后腰膝酸软、下肢痿软评分较治疗前显著下降(P<0.05或P<0.01)，治疗6个月后腰脊疼痛评分较治疗前显著下降(P<0.05)，见表3。

表3 两组患者治疗前后中医症状比较[M(P25,P75)]

2.2 骨密度比较

治疗前两组患者骨密度比较差异无统计学意义(P>0.05)，治疗前后比较差异也无统计学意义(P>0.05)；两组骨密度变化值(治疗后-治疗前)比较，治疗后两组骨密度保持稳定或呈现上升趋势，但组间比较无显著差异(P>0.05)，见表4。

表4 两组患者治疗前后骨密度比较Table 4 Comparison of BMD before and after treatment in the two

2.3 转录组测序差异表达基因分析

转录组测序结果显示，试验组治疗前、后有319个差异基因；试验组治疗前与对照组相比有598个差异基因，其中19个差异基因(包括FOSB、H4C2、RAMP3等)在治疗后的表达显著改变，8个上调基因在治疗后其表达明显下调，11个下调基因在治疗后其表达明显上调(见表5)。

2.4 KEGG通路分析

对19个差异表达基因进行KEGG通路分析，发现FOSB主要参与破骨细胞分化、IL-17信号通路；H4C2主要参与中性粒细胞细胞外诱捕网信号通路、RAMP3参与血管平滑肌收缩信号通路。

表5 19个差异表达基因Table 5 19 differentially expressed genes

3 讨论

PMOP的发生与肾、脾、瘀等关系密切，因此以补肾、健脾、活血为主要治法。续苓健骨颗粒具有补肾壮骨、活血止痛的功效。本研究结果表明续苓健骨颗粒组治疗PMOP中医证候疗效优于对照组，能够明显改善临床症状，两组治疗后骨密度保持稳定或呈上升趋势。与本研究结果类似，也有研究[5-6]发现中医药在半年内提高骨密度效果方面不明显，但能有效地缓解临床症状。慢性疼痛是PMOP的主要临床表现，本研究结果也验证了减轻疼痛、改善临床症状是中医药防治骨质疏松症的优势之一[7-8]。

为了进一步探讨续苓健骨颗粒治疗骨质疏松症的作用机制，本研究通过转录组测序技术，共获得19个差异基因，包括FOSB、H4C2、RAMP3等。这些基因主要参与破骨细胞分化、IL-17信号通路、中性粒细胞细胞外诱捕网信号通路、血管平滑肌收缩信号通路。IL-17可通过刺激细胞表达RANKL，并且抑制OPG表达，而发挥其骨吸收作用[9]。作为IL-17 信号通路的下游，FOSB是AP1复合物家族成员之一，AP1复合物被认为是骨骼发育中的重要调节因子[10]。在本研究中，与对照组相比，试验组FOSB基因表达下调，经续苓健骨颗粒治疗后，FOSB明显上调。因此，笔者推测续苓健骨颗粒治疗PMOP的机理可能与调控IL-17/FOSB信号通路相关。

RAMP基因编码的蛋白是降钙素活性修饰蛋白家族成员之一。RAMP3与CRLR结合形成二聚体作为肾上腺髓质素受体，而肾上腺髓质素能刺激成骨细胞增殖并促进体内骨生长[11]。RAMP3变异会导致老年妇女骨折风险增加[12]。RAMP还能参与血管扩张[13]。因此，笔者推测续苓健骨颗粒可通过RAMP3改善血瘀，促进血管扩张；同时通过调控RAMP3参与骨代谢调节。H4C2是真核生物中负责染色体纤维核小体结构的基本核蛋白。已有研究[14-15]表明组蛋白乙酰化可影响成骨、破骨细胞的分化及成熟。但是H4C2乙酰化是否影响骨代谢，还需要进一步验证。综上所述，笔者推测续苓健骨颗粒治疗PMOP的机理可能与FOSB、RAMP3、H4C2差异基因以及FOSB参与的破骨细胞分化、IL-17信号通路相关。

总之，本研究以补肾活血法治疗肾虚血瘀型PMOP，中医证侯疗效优于对照组，临床症状改善明显。但本研究的观察周期较短，在对骨密度改善以及长期疗效方面值得进一步探讨，同时转录组测序结果也需要更大样本量进行验证。虽然本研究存在一定的局限性，但得出的结果为今后的研究提供了思路，多组学技术的进步也将有利于未来对骨质疏松症发病机制的揭示和相关药物的研发。