熟地黄高压炮制工艺研究*

陈子月 ，彭小园 ，解伟松 ，孙双龙 ，刘兴超 ，4，肖学凤 △

（1. 天津中医药大学中药学院，天津 301617； 2. 河北中医学院，河北 石家庄 050200； 3. 河北仁心药业有限公司，河北 保定 071200； 4. 河北省高校中药组方制剂应用技术研发中心，河北 石家庄 050200）

地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosaLibosch.的新鲜或干燥块根［1］，《神农本草经》将其列为上品。常用入药形式有鲜地黄、生地黄、熟地黄、生地炭、熟地炭等，不同炮制品的性味、功效不同。鲜地黄性寒，味甘苦，清热生津、凉血止血；生地黄性寒，清热凉血、养阴生津；熟地黄性温，补血滋阴、益精填髓［2］。地黄炮制方法在古代有蒸制、熬制、醋炒制等，现代炮制方法主要有生用、酒炒制、炭炒制等［3-4］。《中国药典（一部）》《全国中药材炮制规范》及各省市中药材炮制规范中，熟地黄的现代制法各异，甚至简化为一次性蒸制或酒炖，但炮制时间均过长［5-8］。研究发现，炮制时间与次数对熟地黄的活性成分含量的影响较大［9］。地黄中主要含有环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类、呋喃醛衍生物等化合物［10-11］。本研究中以地黄代表性成分梓醇、地黄苷D、毛蕊花糖苷和5 - 羟甲基糠醛（5 - HMF）为指标性成分，探讨了熟地黄的最佳炮制工艺，为工业化生产提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC - 20AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；ME204E102 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为十万分之一）；YX - 280D 型手提式压力蒸汽灭菌器（合肥华泰医疗设备有限公司）；KQ - 300DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为300 W，频率为40 kHz）；Mili-Q型纯水/超纯水系统（美国Milipore公司）。

1.2 试药

怀地黄（安国市祁利堂中药材销售有限公司，批号为20200316），经河北中医学院郑开颜副教授鉴定为正品；梓醇对照品（批号为AF9030401），毛蕊花糖苷对照品（批号为 AF20110904），5 - HMF 对照品（批号为AF9052005），纯度均不低于98%，均购于成都埃法生物科技有限公司；地黄苷D 对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号为7534，纯度不低于98%）；甲醇为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：WondaSil®C18-WR柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-水溶液（B），梯度洗脱（程序见表1）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：210 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。在此色谱条件下的色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图1.Catalpol 2.5 - HMF 3.Rehmannioside D 4.VerbascosideA - B.Test solution（Rehmanniae Radix and Rehmanniae Radix Praeparata） C.Mixed control solutionFig.1 HPLC chromatograms

表1 流动相梯度洗脱程序（%）Tab.1 Gradient elution procedure of the mobile phase（%）

2.1.2 溶液制备

取怀地黄/ 熟地黄粗粉0.1 g，精密称定，加25 mL 50%甲醇溶解，称定质量，加热回流30 min，放冷至室温，用50%甲醇补足减失的质量，用0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。分别取梓醇、5-HMF、地黄苷D、毛蕊花糖苷对照品4.44，4.40，6.02，3.49 mg，精密称定，置10 mL 容量瓶中，用甲醇 - 水溶液（50∶50，V/V）定容，超声处理（功率为300 W，频率为40 kHz）至完全溶解，配制成上述4种成分质量浓度分别为0.444，0.440，0.602，0.349 mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：取2.1.2 项下混合对照品溶液，分别吸取2，6，10，14，18 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇 -水溶液（50∶50，V/V）定容，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，以各成分的质量浓度（X，mg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程。结果见表2。

表2 线性关系考察结果（n=5）Tab.2 Results of linear relationship test（n=5）

精密度试验：取2.1.2 项下混合对照品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定6 次，记录各对照品的峰面积。结果梓醇、5-HMF、地黄苷D、毛蕊花糖苷峰面积的RSD分别为0.20%，0.29%，0.09%，0.34%（n= 6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取2.1.2 项下供试品溶液20 μL，分别于0，3，6，9，12 h 时按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果梓醇、5 - HMF、地黄苷D和毛蕊花糖苷峰面积的RSD分别为1.40%，1.60%，0.46%，0.62%（n= 5），表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

重复性试验：取2.1.2 项下供试品溶液适量，共6份，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果梓醇、5-HMF、地黄苷D、毛蕊花糖苷含量的RSD分别为0.35%，0.79%，0.95%，1.86%（n= 6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品0.1 g，精密称定，依法制备供试品溶液，取10 mL，共6 份；分别取梓醇、5 - HMF、地黄苷D、毛蕊花糖苷对照品0.171，0.205，0.333，0.306 mg，精密称定，加入每份供试品溶液中，超声处理（功率为300 W，频率为40 kHz）使完全溶解，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表3。

环保型水利工程的建设可减少空气污染。在施工过程中，需要减少施工现场的烟尘，减少废气中有害气体的排放。进行材料运输时，需要采用封闭性较好的运输车，同时使用洒水车进行辅助，从而减少粉尘污染。使用工程机械时，需要安装除烟尘装置。对于废水以及废弃物对环境的污染问题，需要严格按照相关标准进行控制，可对废水和废弃物进行处理后回收利用，对于不可回收的材料，需要严格按照相关标准进行处理，严禁随意丢弃，如重金属材料。

表3 加样回收试验结果（n=6）Tab.3 Results of recovery test（n=6）

2.1.4 样品含量测定

取各蒸制时间段的样品适量，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定3 次，记录峰面积，并计算各蒸制时间段4 个成分的含量。结果见表4和表5。

表4 120 ℃条件下地黄一次蒸制各成分含量测定结果（%，n=3）Tab.4 Determination results of various ingredients content in Rehmanniae Radix first steaming at 120 ℃（%，n=3）

表5 120 ℃条件下地黄二次蒸制各成分含量测定结果（%，n=3）Tab.5 Determination results of various ingredients content in Rehmanniae Radix second steaming at 120 ℃（%，n=3）

2.2 炮制工艺研究

采用高压炮制熟地黄。1）高压一次蒸制：将生怀地黄清洗干净，置高压锅中，设蒸制温度为120 ℃，分别蒸制10，15，20，25，30，35，40 min，蒸制完毕，取出，切片，晾干，用于含量测定。2）高压二次蒸制：将生怀地黄清洗干净，置高压锅中，设蒸制温度为120 ℃，先蒸制10 min，然后加入40%的水焖润4 h，再分别蒸制10，20，30，40 min，蒸制完毕，取出，切片，晾干，用于含量测定。

含量测定结果：高压一次蒸制和高压二次蒸制各成分含量变化见表4 和表5。可见，2 次蒸制梓醇、地黄苷D和毛蕊花糖苷的含量都随蒸制时间的增加而降低，而5-HMF的含量随蒸制时间的增加而升高。梓醇的含量在蒸制过程中下降很快，毛蕊花糖苷的含量也下降较快，而地黄苷D的含量在炮制过程中虽有下降，但下降幅度不高。一次蒸制40 min时，梓醇含量为0，5-HMF、地黄苷D 和毛蕊花糖苷的含量分别为0.37%，0.67%，0.14%；二次蒸制20 min 时，梓醇含量为0，5-HMF、地黄苷D 和毛蕊花糖苷的含量分别为0.14%，0.67%，0.17%，均符合2020 年版《中国药典（一部）》中熟地黄含量测定标准。

外观评价：高压一次蒸制40 min 时，切制的熟地黄片仍不符合《中国药典》要求；高压二次蒸制20 min 时，切制的熟地黄均符合要求。

优选的炮制工艺：通过分析4 种成分的含量变化和对炮制品外观评价，优化了熟地黄的炮制工艺，即高压二次蒸制，将生地黄先蒸制10 min，用水或黄酒焖润4 h，再蒸制20 min。第1 次蒸制的目的是加快水的吸收、焖润完全。分别考察二次蒸制10，20，30，40 min 时炮制熟地黄成品的外观，结果二次蒸制20 min 能完全满足试验要求，达到了二次蒸制的目的。

3 讨论

3.1 色谱条件优化

3.2 指标成分选择

参考2015 年版和2020 年版《中国药典（一部）》中生地黄和熟地黄的检测指标，选取梓醇、毛蕊花糖苷和地黄苷D 作为检测指标。地黄炮制过程中，大多数成分含量都呈下降趋势，而5-HMF 的含量明显上升，故选择5-HMF为熟地黄炮制过程变化的标志物。

3.3 药材产地差异影响炮制质量

炮制过程中，发现生地黄若用水或黄酒焖润透，进一步蒸制所需时间就会缩短，而由于产地差异问题，在焖润过程中，生地黄内部存在硬芯，导致蒸制时间即使延长也会出现不合格产品。

3.4 方法评价

二次蒸制可获得合格的熟地黄，通过对熟地黄中指标性成分的测定与炮制过程中成分含量变化的比较，优化熟地黄的炮制新工艺在保证产品质量的同时大大缩短了炮制时间，为熟地黄的工业化生产提供了参考。