温阳消癥方对5/6肾切除小鼠肾纤维化的保护作用及对TGF-β1/Smad3信号通路的影响

林晓蒙 蔡旭东 钟光辉 余柯娜 伍云洲 何立群

1.浙江中医药大学附属宁波中医院 宁波 315000 2.上海中医药大学附属曙光医院

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是指由各种原因引起的慢性肾脏结构和功能异常，影响到全球9.1%的人口，中国有约1.32亿例CKD患者，每年有数百万患者死于CKD进展后的终末期肾脏病（end stage renal disease，ESRD）[1]。 肾纤维化是CKD进展的病理基础及最终结局，包括肾小球硬化、肾小管间质纤维化以及动脉硬化和血管周围纤维化[2]，与肾功能损害的严重程度及预后有密切联系[3]。

转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是最主要的促纤维化因子之一，TGF-β1/Smad3信号通路在肾纤维化过程中发挥了重要作用[4-5]。细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的异常沉积是肾纤维化的主要病理改变。α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA） 和纤维连接蛋白（fibronectin，FN）是ECM的主要成分，也是促进ECM异常沉积的因素。

目前尚未开发出针对肾纤维化的靶点治疗药物，临床治疗主要采用肾素-血管紧张素系统抑制剂，但疗效有限，而且由于可影响肾小球滤过率，或导致高钾血症等原因，导致临床应用受到一定限制，故能实际应用于临床的药物仍亟待开发。中医药在肾纤维化治疗方面有良好疗效，且中药的多靶点性、经济性、安全性已逐渐受到重视。

温阳消癥方是浙江中医药大学附属宁波中医院国家级名老中医张沛虬老先生治疗CKD的经验方，临床应用证实疗效良好，可降低CKD患者的尿蛋白，改善肾功能，减轻临床症状[6]。既往动物实验证实，该方可改善单侧输尿管梗阻小鼠的肾功能，抑制Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达[7-8]。

本研究拟通过建立5/6肾切除小鼠模型，观察温阳消癥方对小鼠肾纤维化的保护作用，以及对TGF-β1/Smad3信号通路和α-SMA、FN的影响，进而探讨温阳消癥方抑制肾纤维化可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雄性无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级C57BL/6小鼠40只，6～8周龄，体质量16～18 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005]，饲养于上海中医药大学动物房[实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2020-0009]。所有小鼠以标准饲料及水适应性喂养1周。本研究已通过上海中医药大学动物伦理委员会批准（伦理审批号：PZSHUTCM210507018）。

1.2 药物 温阳消癥方（组成：黄芪30 g，党参30 g，仙灵脾15 g，肉苁蓉15 g，桃仁12 g，川芎15 g，莪术30 g）由浙江中医药大学附属宁波中医院中药房提供。缬沙坦胶囊（规格：80 mg×7粒）购于诺华制药有限公司（国药准字：H20040217）。

1.3 主要试剂与仪器 血清肌酐试剂盒、尿素氮试剂盒均购于宁波美康生物科技股份有限公司（批号：210403101、210421201）；苏木精-伊红（hematoxylineosin，HE）染色试剂盒、Masson染色试剂盒均购于北京索莱宝科技有限公司（批号：G1121、G1345）；通用反转录试剂盒、总RNA抽提试剂盒、ComSYBR qPCR Mix（with ROX）试剂均购于上海诺伦生物医药技术有限公司（批号：LR-0103B、LN-0108B、LK-0107BB）；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体及山羊抗小鼠IgG抗体均购于上海翌圣生物科技股份有限公司（批号：33106ES60、33206ES60）；TGF-β1抗体、Smad3抗体、α-SMA抗体、FN抗体均购于Jakeson公司（批号：ab92486、ab40854、ab32575、sc-81767）。 MX3000P型实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，Realtime qPCR）仪购于德国Agilent公司；VE-180型垂直电泳槽购于天能公司；DY-B1型脱色摇床购于上海青浦沪西仪器厂；KODAK X-Omat BT Film、X光片显影液及定影液均购于Kodak公司。

1.4 5/6肾切除小鼠模型的建立和干预

1.4.1 分组与建模 C57BL/6小鼠中随机选取10只作为假手术组，其余按照文献[9]描述的方法制作5/6肾切除模型。手术分两期，一期切除左肾2/3肾组织，使用异氟烷麻醉机，以5%异氟烷诱导麻醉，2～3 min后确认小鼠已完全麻醉，置于恒温加热垫，麻醉面罩对准口鼻，调节氧流量维持麻醉（异氟烷浓度1.0%～1.5%），仰卧位暴露左侧胸腹部并清除毛发，碘伏消毒后于左肋下1 cm处，45°斜向外下方切开1 cm，取出左肾，分离肾周脂肪及包膜，切除肾脏上下极组织（上下各1/3），并立即用明胶海绵压迫止血10 min，确定无活动性出血后将左肾复位，逐层关闭并缝合。7 d后行二期手术，按上法麻醉，取出并暴露右肾，将右肾蒂结扎，切除右肾，并缝合。两期手术共切除5/6的肾脏。假手术组麻醉后仅暴露双侧肾脏，分离肾周脂肪、包膜后缝合肌肉及皮肤。

术后14 d，内眦采血测定血清肌酐水平，共30只小鼠确定造模成功，将造模的30只小鼠随机分为模型组、缬沙坦组、温阳消癥组，每组各10只。

1.4.2 给药 术后14 d，假手术组及模型组每日以0.9%氯化钠注射液0.2 mL灌胃；温阳消癥组每日予温阳消癥方水煎剂0.2 mL灌胃，人鼠药物剂量按20倍换算[10]，小鼠给药剂量为49 g/（kg·d）；缬沙坦组每日予缬沙坦胶囊水悬液0.2 mL灌胃，人鼠药物剂量按12.33倍换算[11]，小鼠给药剂量16.5 mg/（kg·d）。各组灌胃均持续8周。

1.4.3 取材 给药疗程结束后，各组小鼠予10%水合氯醛（0.6 mL/100g）麻醉后眼眶采血，静置后2 000 r/min离心10 min，分离血清，检测血清肌酐、尿素氮水平。采血后颈椎脱臼处死小鼠，留取肾组织，一半置于4%多聚甲醛溶液中固定，以备染色观察；另一半液氮速冻后-80℃保存，以备mRNA及蛋白表达检测。

1.5 指标检测

1.5.1 生化指标检测 血清肌酐、尿素氮的检测根据试剂盒说明书操作。

1.5.2 肾组织病理学观察

1.5.2.1 HE染色 取出4%多聚甲醛溶液固定的肾组织，脱水，石蜡包埋、切片后进行染色，400倍光镜下观察肾小球、肾小管上皮细胞，间质炎症细胞浸润及纤维化情况。

1.5.2.2 Masson染色 分别以Weigert铁苏木素、丽春红酸性品红染液、磷钼酸溶液、苯胺蓝染液等处理切片，光镜下观察肾间质蓝染区域，每只小鼠制作5张切片，400倍光镜下每张切片随机选取5个不重叠视野（排除肾小球部分），使用Image-Pro plus 6.0软件分析胶原染色阳性率，然后取平均值。

1.5.3 Real-time qPCR检测肾组织α-SMA、FN、TGF-β1、Smad3 mRNA的表达 提取总RNA后行逆转录反应，逆转录体系包括：总RNA 5 μL、2×逆转录缓冲液10 μL、逆转录引物1.2 μL、Money鼠白血病病毒（Money murine leukemia virus，MMLV） 逆转录酶0.2 μL，并以焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）水加至20 μL；反应条件：30 ℃ 30 min，42 ℃ 30min，85℃ 10 min。PCR反应体系包括：2×Master Mix 10 μL、上下游引物0.08 μL、cDNA模板2 μL、Taq DNA聚合酶0.2 μL，用dd H2O加至20 μL；反应条件：变性95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，共40个循环。读取循环阈值（cycle threshold，CT）值并计算2-△△CT值，表示mRNA相对表达量。PCR引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5.4 免疫印迹法检测肾组织α-SMA、FN、TGF-β1、Smad3蛋白的表达 组织细胞样本裂解后，提取总蛋白并进行蛋白定量，取10 μL行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）电泳，完成电泳后，4℃转膜封闭过夜，洗涤后加入一抗（稀释比例分别为α-SMA 1∶1 000，FN 1∶100，TGF-β11∶300，Smad3 1∶1 000）37 ℃温育2 h，再次洗涤后加入二抗（稀释比例为1∶2 000）37 ℃温育2 h，洗涤后化学发光检测，显影定影后以凝胶成像分析系统拍照，使用Gel-Pro Analyzer软件进行分析处理。

1.6 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，两组间比较使用独立样本t检验，多组间比较使用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠生化指标比较 造模术后第14天，造模组小鼠血肌酐（18.67±1.92）μmol·L-1较假手术组（9.60±1.90）μmol·L-1显著升高（P＜0.01），提示造模成功。给药8周后，温阳消癥组和缬沙坦组的小鼠血肌酐、尿素氮均较模型组显著降低（P＜0.01），温阳消癥组与缬沙坦组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠肾功能指标比较Tab.2 Comparison of renal function indexes in each group（±s）

表2 各组小鼠肾功能指标比较Tab.2 Comparison of renal function indexes in each group（±s）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，ΔΔP＜0.01。Note:Compared with sham operation group，**P＜0.01;compared with model group，ΔΔP＜0.01.

组别 n 肌酐（μmol·L-1） 尿素氮（mmol·L-1）假手术组 10 9.70±3.13 15.76±1.41模型组 10 21.90±4.18** 27.00±1.90**缬沙坦组 10 17.60±2.50ΔΔ 22.71±2.10ΔΔ温阳消癥组 10 15.80±1.87ΔΔ 22.39±1.68ΔΔ

2.2 各组小鼠肾组织病理改变比较 HE染色提示，假手术组肾小球结构完整，毛细血管襻开放良好，小管间质无炎症细胞浸润；模型组可见肾小球硬化，系膜细胞及基质增生，肾小管萎缩，小管上皮细胞脱落、空泡变性，肾小管管腔扩张，肾间质炎性细胞浸润；温阳消癥组及缬沙坦组上述病理改变较模型组轻微。Masson染色提示，模型组肾间质明显蓝染区域增多，与假手术组比较，模型组胶原染色阳性率显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，温阳消癥组与缬沙坦组胶原染色阳性率显著降低（P＜0.01）；与缬沙坦组比较，温阳消癥组胶原染色阳性率降低（P＜0.05）。见图1～3。

图1 各组小鼠肾组织病理改变（HE染色，400×）Fig.1 Renal histopathological changes in each group （HE staining， 400×）

图2 各组小鼠肾组织胶原染色（Masson染色，400×）Fig.2 Collagen staining of renal tissue in each group（Masson staining， 400×）

图3 各组胶原染色阳性率比较Fig.3 Comparison of collagen staining positive rates in each group

2.3 各组小鼠肾组织α-SMA、FN mRNA和蛋白表达比较 与假手术组比较，模型组α-SMA、FN mRNA和蛋白表达均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，温阳消癥组和缬沙坦组α-SMA、FN mRNA和蛋白表达均显著降低（P＜0.01）；与缬沙坦组比较，温阳消癥组α-SMA mRNA和蛋白表达均显著降低（P＜0.01），FN的mRNA表达降低（P＜0.05）。 见图4、5。

图4 各组小鼠肾组织α-SMA、FN mRNA表达比较Fig.4 Comparison of α-SMA and FN mRNA expression of renal tissue in each group

图5 各组小鼠肾组织α-SMA、FN蛋白表达比较Fig.5 Comparison of α-SMA and FN protein expression of renal tissue in each group

2.4 各组小鼠肾组织TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白表达比较 与假手术组比较，模型组TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白表达均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，温阳消癥组及缬沙坦组TGF-β1mRNA和蛋白表达 、Smad3蛋白表达均显著降低（P＜0.01），Smad3 mRNA表达均降低 （P＜0.01，P＜0.05）；与缬沙坦组比较，温阳消癥组TGF-β1mRNA的表达显著降低（P＜0.01）。 见图6、7。

图6 各组小鼠肾组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达比较Fig.6 Comparison of TGF-β1and Smad3 mRNA expression of renal tissue in each group

图7 各组小鼠肾组织TGF-β1、Smad3蛋白表达比较Fig.7 Comparison of TGF-β1and Smad3 protein expression of renal tissue in each group

3 讨论

肾纤维化是有多种因素共同参与的进展性过程，炎症、缺氧、高血糖、蛋白尿等一种或多种致病因素引起肾脏固有细胞损伤，大量炎性因子活化释放，炎症细胞浸润，促纤维化因子和抗纤维化因子失调，肌成纤维细胞激活，导致ECM合成和分解失衡，ECM大量沉积，最终形成纤维化瘢痕组织，在这一过程中，中心环节即为肌成纤维细胞的激活和ECM合成降解失调[12-13]。

肾纤维化尚无特效药物，目前临床疗效较为确切的首选药物为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（angiotensin Ⅱ receptor antagonist，ARB），其可阻断血管紧张素Ⅱ对TGF-β1的过度活化作用，从而改善肾纤维化，故本研究选取ARB缬沙坦作为阳性对照药物。

传统医学中并无“CKD、肾纤维化”之名，相关内容多见于“溺毒、关格、水肿、血尿、虚劳、尿浊”等疾病中。国家级名中医王永钧教授[14]提出肾纤维化是“肾内微型癥积”的学说，从中医角度认为肾纤维化是病邪侵入肾络，瘀毒痰湿等病理产物久积肾络，导致肾络瘀阻，最终引起微型癥积的过程，这与西医损伤因子导致成纤维细胞增生-微循环持续受损-肾纤维化形成的过程极其相似[15]，张沛虬老先生的温阳消癥方也契合了这一理论。从“肾内微型癥积”的理论联系肾纤维化的发病机制，阳虚血瘀是其重要病机。肾病之人，常有先天不足，后天失养，脾肾阳虚，久病则脉络瘀阻，《素问·调经论》中指出：“气血者，喜温而恶寒，寒则泣而不行，温则消而去之。”血为阴，得阳则运，若阳虚火衰，则血失其运，凝于脉中，结为瘀滞，可见阳虚与血瘀之间有密不可分的关系。温阳消癥方益气温阳、活血消癥，方中黄芪为补气要药，与党参共用，加强健脾益气之功，使后天脾胃之本化生有源。肾主一生之阴阳，肾阳为“诸阳之本”，促进人体生理机能的运行，仙灵脾、肉苁蓉温补肾阳，促进先天之阳与脾胃之阳互生互通。桃仁、莪术、川芎均可活血化瘀，而莪术重在消癥理气，川芎行气祛风，三者共用，可改善肾内微型癥积。诸药合用，共奏扶正化瘀、延缓纤维化之效。

研究证实，温阳消癥方中多种成分具有抗肾纤维化的作用。黄芪是中医肾病学中研究最广泛的药物之一，其主要有效成分黄芪甲苷，可减轻5/6肾切除肾衰大鼠肾功能及肾脏病理损伤[16]；在糖尿病肾病小鼠模型中，黄芪甲苷可减少TGF-β1的表达，抑制TGF-β1/smad信号通路，延缓肾纤维化进展[17]。淫羊藿总黄酮减少糖尿病大鼠TGF-β1的表达，缓解肾损伤[18]。桃仁可上调单侧输尿管梗阻 （unilateral ureteral occlusion，UUO）大鼠上皮细胞钙黏蛋白、α-SMA的表达，下调FN表达，从而抑制肾小管上皮细胞转分化，减缓肾纤维化进程[19]。川芎的有效成分川芎嗪可下调UUO大鼠肾组织中TGF-β1水平，同时上调Smad逆向调控因子Smad7和转录共抑制因子（ski-related novel protein N，SnoN）蛋白表达水平，从而减轻肾纤维化[20]。

本研究结果显示，术后第14天，造模组小鼠血肌酐水平较假手术组显著升高，提示造模成功。给药8周后，两个治疗组小鼠血肌酐、尿素氮水平较模型组显著降低，与缬沙坦组比较，温阳消癥组肌酐、尿素氮水平差异虽无统计学意义，但呈降低趋势。病理形态学观察提示，两个治疗组的肾小球、肾小管损伤程度，以及温阳消癥组的间质损伤程度较模型组减轻，胶原染色阳性率显著低于模型组，而且温阳消癥组优于缬沙坦组。此结果提示，温阳消癥方对肾纤维化小鼠的肾功能及病理形态改变有改善作用。

肾纤维化的严重程度与肌成纤维细胞数量呈正相关，α-SMA是肌成纤维细胞独特的标记蛋白，可以使后者收缩迁移能力显著增加，并大量分泌ECM[21]。FN是ECM的关键成分，生理情况下，FN维持细胞的正常形态，参与细胞之间、细胞与基质之间的连接；病理状态下，FN可作为其他ECM成分之间的支架，促进ECM聚集，并对炎症细胞有趋化作用[22]。本研究结果显示，温阳消癥组及缬沙坦组的小鼠α-SMA及FN mRNA和蛋白表达均显著低于模型组；与缬沙坦组比较，温阳消癥组α-SMA mRNA和蛋白的表达均显著下降，FN的mRNA表达降低，提示温阳消癥方可显著下调肾纤维化关键指标α-SMA及FN的表达，减少ECM沉积。

TGF-β1是肾纤维化的中枢介质，可诱导间质成纤维细胞活化成为表达α-SMA的肌成纤维细胞，促进ECM的合成。Smad信号系统在调节TGF-β1中起核心作用，在肾纤维化和炎症的情况下，Smad3发挥促纤维化作用[23-24]。研究发现，中药复方或中药有效成分能够通过TGF-β1/Smad3通路改善肾纤维化[25-30]。本研究结果显示，温阳消癥组和缬沙坦组TGF-β1mRNA和蛋白表达及Smad3蛋白的表达均显著低于模型组，Smad3 mRNA的表达低于模型组；与缬沙坦组比较，温阳消癥组TGF-β1mRNA的表达显著下降。可见温阳消癥方能够下调TGF-β1、Smad3的表达，提示其减轻肾纤维化的机制可能与调控抑制TGF-β1/Smad3信号通路有关。

综上所述，温阳消癥方可改善5/6肾切除小鼠肾功能，减轻病理形态改变，下调肾纤维化标志物α-SMA及FN的蛋白和mRNA表达，减轻ECM异常沉积，其机制可能与抑制了TGF-β1/Smad3信号通路有关。本研究为中医药治疗肾纤维化提供了新的证据，但仍然存在以下不足：首先，温阳消癥方的具体有效成分尚不明确，仍需进一步研究，如以高效液相色谱法分析中药复方有效成分；其次，本研究的机制研究不够深入，未来可从分子生物学的角度进一步深入研究。