循环肿瘤细胞评估甲状腺髓样癌预后的应用价值初步研究

姜磊，黄婧，许莹莹，辛勇，宋玮

(1.徐州医科大学 研究生学院，江苏 徐州 221004； 2.南京医科大学附属淮安第一医院 放疗科，江苏 淮安 223000； 3.徐州医科大学附属医院 放疗科，江苏 徐州 221000； 4.南京医科大学附属淮安第一医院 甲乳科，江苏 淮安 223000)

甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma，MTC)是一种来源于分泌降钙素的C细胞恶性肿瘤，发病率为0.21/10万[1]。MTC较分化型甲状腺癌更容易发生局部复发和远处转移[2]。外科手术后甲状腺癌患者主要通过影像学检查监测复发或转移，但一般影像学检查如颈部B超难以发现MTC微转移病灶[3]。同时外周血中肿瘤微小病灶对治疗和预后的影响难以准确评估。循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)是渗入血液的肿瘤细胞，被认为是“肿瘤转移和复发的基础”[4]。研究证实CTC在乳腺癌、非小细胞肺癌和头颈部鳞癌中具有预后评估价值[5- 7]。国内外对CTC在MTC患者中作用的相关研究较少，而CTC还可以无创性动态连续检测外周血微转移肿瘤细胞，本研究初步探讨CTC用于评估MTC预后的价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2016年1月至2019年1月于南京医科大学附属淮安第一医院就诊的45例MTC患者。纳入标准：(1) 年龄18～75岁；(2) 有完整的临床病理和随访资料；(3) 治疗前抽血进行过CTC计数检测；(4) 经组织病理学明确诊断；(5) 过去5年未患甲状腺癌或其他恶性肿瘤。排除标准：(1) 孕妇；(2) 已接受手术、化疗、生物治疗或免疫治疗；(3) 患有其它甲状腺疾病；(4) 失访。总计排除9例，包括CTC检测前已接受治疗的复发患者4例、妊娠者1例、失访者2例、伴其它甲状腺疾病者2例，36例MTC患者最终被纳入研究。36例患者年龄37～85岁，中位年龄65岁；随访时间28.6～60个月，中位随访时间36.8个月，随访截至2021年6月。患者临床特征如表1所示。本研究得到南京医科大学附属淮安第一医院伦理评审委员会的批准，患者均签署知情同意书。

1.2 预后评估方法

本研究通过无进展生存期(progression free survival，PFS)即从开始到进展或死亡的时间和总生存期(overall survival，OS)即从开始到死亡或最后一次随访的时间来评估预后。

1.3 CTC检测

治疗前应用含乙二胺四乙酸的真空采血管采集患者10 ml静脉血，全血样本临时4 ℃储存。为每个样品分配一个识别号，并从试管中移除任何其他标签，确保以单盲方式进行。取7.5 ml血液标本用CTC检测试剂盒(强生，美国)经CellSearch系统检测CTC。负向免疫磁微粒法使用的是涂有亲水性聚醚交联层的聚苯乙烯珠，通过免疫磁珠[上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM+)、CD45、角蛋白和核染色剂DAPI作为标记物]富集联合免疫荧光染色检测CTC[8]。

1.4 统计学处理

应用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计数资料用χ2检验或近似Fisher检验，生存分析用Cox回归模型。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 CTC与患者临床资料之间的关系

以每7.5 ml血液CTC计数≥1为CTC阳性，本研究CTC阴性者15例，阳性者21例，CTC阳性率为58.3%。36例患者中27例为散发性MTC，9例为遗传性MTC(5例MEN2A型、2例MEN2B型、2例其他类型)。在散发性MTC患者中，M918T是最常见的转染重排(RET)基因突变，RET基因突变的18例患者中，有12例RET M918T突变。36例患者中，13例为T3～T4期。本研究患者中最常见的远处转移部位依次为肺、骨及肝。在CTC阳性组与阴性组间，TNM分期、癌胚抗原(CEA)及降钙素(Ct)表达水平差异有统计学意义(P<0.05)，其他变量如年龄、性别、肿瘤类型、基因突变、肿瘤异型性及肿瘤分化程度差异无统计学意义。两组患者临床病理特征、CEA及Ct表达情况等见表1。

表1 患者CTC与临床资料的关系

(续表)

2.2 CTC与PFS的关系

36例患者中，CTC阳性组的PFS短于CTC阴性组(P<0.05)，且CTC阳性组转移和复发数量均多于CTC阴性组，提示CTC阳性可能与MTC患者的肿瘤转移或复发相关。

2.3 CTC与OS的关系

随访期间3例(CTC阳性组2例、阴性组1例)患者死亡，死亡率8.3%，CTC阳性组死亡的2例中转移和复发各1例。33例患者生存，生存率91.7%。CTC阳性组的OS短于CTC阴性组(P<0.05)，提示CTC阳性者可能预后较差。

2.4 生存时间的Cox回归模型分析

用Cox回归模型对患者的临床资料及CTC水平进行分析：单因素分析结果显示，患者年龄、肿瘤TNM分期及CTC、CEA、Ct水平是影响患者生存时间的危险因素(P<0.05)；多因素分析结果显示，肿瘤TNM分期及CTC、CEA、Ct水平是影响患者生存时间的独立危险因素(P<0.05)。见表2。

表2 影响患者生存时间危险因素的Cox回归模型分析结果

3 讨 论

MTC患者对放射性碘治疗反应差，故手术是首选治疗方法。甲状腺切除术后10年生存率约为75%。MTC较分化型甲状腺癌更具有侵袭性，特别是转移性或复发性MTC预后极差，故早期筛选出容易转移或复发的MTC有助于改善预后。目前临床上通过监测癌胚抗原和血清降钙素水平来长期跟踪MTC患者，存在诸如参考值范围不统一和异嗜性抗体导致假阳性产生等局限性[9- 10]。研究发现，接受酪氨酸激酶抑制剂治疗的晚期MTC患者降钙素及CEA的表达水平变化与肿瘤预后无关[11]，因此临床亟需寻找评估MTC预后的新型标志物。CTC为原发或转移性肿瘤组织细胞脱落并渗入血液中的肿瘤细胞[12]，因此本研究探讨通过CellSearch系统检测治疗前MTC患者的CTC水平在评估预后中的作用。

本研究结果显示，36例MTC患者的总生存率为91.7%，CTC阳性率为58.3%，与之前研究[13]结果相似。CTC阳性患者OS和PFS短于阴性患者，提示CTC阳性MTC患者预后差，这与其它研究[13- 14]结果相似。治疗前CTC浓度可能是影响MTC预后的独立危险因素。由于CTC数量与肿瘤复发的可能性相关，因此CTC阳性MTC患者具有病情恶化风险，应继续随访该类患者并有待在更大的队列中进一步验证。

本研究结果还表明，CTC浓度与肿瘤TNM分期、CEA及Ct水平相关，与年龄、性别、基因突变位点、肿瘤异型性及分化性无关，这与其它研究[15]结果一致。为了排除与预后相关的各种因素的相互作用，本研究进行多变量分析，发现只有CTC浓度、肿瘤TNM及CEA、Ct水平是影响MTC预后的独立危险因素。本研究发现，转移性MTC患者治疗前CTC浓度明显高于未转移患者，多发远处转移患者治疗前CTC浓度最高。因此，治疗前CTC浓度可作为预测MTC临床预后的生物标志物。最后本研究发现，死亡的3例MTC患者血清CEA及Ct水平均高于平均值，故联合CTC与降钙素、癌胚抗原动态监测MTC患者可能是下一步研究重点。