南京都市圈肾综合征出血热疑似病例血清学检测及基因亚型分析

董晓庆，石利民，王雅倩，何 敏，丁松宁，张守刚

汉坦病毒(Hantavirus，HV)属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)、汉坦病毒科(Hantaviridae)、正汉坦病毒属(Orthohantavirus)，其基因组包括L、M、S三个片段，分别编码多聚酶、病毒糖蛋白Gn、Gc和核衣壳蛋白，可以通过吸入含有病毒颗粒的小型哺乳动物(主要是啮齿动物)排泄物的气溶胶等方式传播给人类[1]。HV在我国主要引起肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)，临床上表现为发热、出血及肾功能损伤。汉坦病毒有至少40个血清型/基因型，能引起HFRS的有7个型[2]，其中汉滩病毒(hantaan virus，HTNV)和汉城病毒(seoul virus，SEOV)为我国HFRS的主要病原体[3]。

汉坦病毒感染危及世界30多个国家和地区，在我国亦是重大公共卫生问题[4-5]。本研究抽取南京市部分三甲医院临床诊断为HFRS疑似患者的血清标本，应用胶体金、荧光定量PCR法、基因测序等方法进行样本检测，并对病毒基因序列进行分析。

1 材料与方法

1.1 样本来源 2019-2021年南京市鼓楼、中大等三甲医院收治的临床诊断为HFRS疑似患者的血清122份,患者主要来自于南京及周边区域。

1.2 抗体检测 选用北京贝尔生物工程有限公司生产的汉坦病毒IgM/IgG抗体检测试剂盒(胶体金法)，在试剂条加样孔中分别加入待检血清10 μL和标本稀释液100 μL，20 min 内观察结果。只显示对照线为阴性，对照线和检测线均出现的为阳性，无对照线的实验结果无效。

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HV是有包膜的病毒，不耐热和耐酸，也对脂溶剂、酒精、紫外线等敏感，故在样本运送过程中，如保存不当容易造成 RNA 的降解。本次研究中有2份标本荧光 PCR 结果阴性，但经巢式 PCR 扩增后测序，获得了 M 片段部分基因序列。巢式 PCR 通过使用两对 PCR 引物进行两轮扩增的方法，不但增加了扩增倍数使得反应灵敏度大大提升，而且还降低了非特异性扩增导致的污染。所以，当样本中模板较低的时候，可以用巢式PCR的方法进行扩增。 HFRS 的发病主要是病毒直接作用所致，患者发病7～10 d内可检出HV 病毒 RNA[9]，所以，在发病早期进行核酸检测，不仅有助于疾病的早期诊断，病毒载量的高低还关系到疾病的治疗及愈后[10]。但在疾病中后期，随着抗体的产生，病毒逐渐减少或被抗体中和，此时病毒核酸难以检出。本次研究中患者血清IgM从第3 d开始检出，7～8 d达到高峰，之后随病程的增加阳性数量逐渐减少，病毒核酸阳性则集中在发病7 d内，所以，需要结合核酸和抗体的实验结果对疑似病人进行实验室诊断。

1.4 M片段部分区域RT-PCR扩增及测序

1.4.1 引物设计与合成 根据《全国肾综合征出血热检测方案》中提供的引物序列，委托上海生工合成。详见表1。

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1.5 基因同源性及系统进化分析 使用 DNAStar 软件包中的 seqman 软件对得到的序列进行拼接及编辑，从 GenBank 上下载HTNV和SEOV国际标准株、中国代表株以及各亚型代表株(部分毒株资料见表2)，使用MEGA5.0中的 CLUSTAL MUSCLE 程序针对与扩增片段位置相同的 M 片段部分基因进行序列比对，并构建系统进化树，使用 MegAlign 软件进行同源性分析。

序列经过拼接、编辑、校正后，分别命名为SNJ1-15。与HV国际标准株76-118、80-39，中国代表株 84FLi、L99 以及疫苗株 Z10、Z37 等毒株的相同位置 M 片段部分基因进行同源性比对，结果发现 SNJ2-SNJ5 号样本间的核苷酸同源性为94%～97.7%，与 84FLi 株的核苷酸同源性较高，为95%～98.3%，与其他各株核苷酸同源性均低于87.4%。 SNJ6-SNJ12 样本间的核苷酸同源性在97.3%～100%，与HV114株具有较高同源性,而与其他各株核苷酸同源性较低。 SNJ1 样本与 Bao14 株的核苷酸同源性较高，为97.3%，与其他各株核苷酸同源性均低于90%。 SNJ13、14 号样本与其他样本以及76-118、其他代表株的同源性均小于87.4%。 SNJ15 号样本与 Z37 株核苷酸同源性最高，为96.3%。详见图1。

1.4.3 电泳与测序 对经过巢式PCR扩增后获得的产物使用毛细管电泳鉴定，Alignment marker选择15 bp～1 kb，Size maker选择50～800 bp。如扩增出的片段大小与预期片段(382 bp和417 bp)大小一致，则为扩增成功。将该扩增产物委托上海生工完成双向测序。

表2 遗传进化分析部分参考毒株Tab.2 Sources of reference strains

2 结 果

2.1 疑似患者不同病程3种方法检测结果及确诊情况 本次检测的122份肾综合征出血热疑似病例中有29例经实验室诊断后判定为确诊病例。其中IgM抗体阳性27份，阳性率22.1%，IgG阳性57份，阳性率46.7%；HV核酸阳性13份，阳性率10.7%。对上述确诊病例血清标本进行巢式 PCR 扩增， 14份使用HTNV特异性引物扩增后，得到与预期目的片段大小(382 bp)一致的阳性扩增条带，1份使用SEOV特异性引物扩增后，得到与预期目的片段大小(417 bp)一致的阳性扩增条带。详见表3。

2.2 M片段的部分基因同源性分析 对15份巢式 PCR 扩增结果为阳性的标本进行双向测序，所得的

表3 疑似患者不同病程3种方法检测结果及确诊情况Tab.3 Detection results and diagnosis of patients with different suspected stages of disease through three methods

但很快，他又跟我谈起他跟其他行业顶尖人物在探讨的跨界，有时尚界的，有文化界的。比如今年3月，他就和怡园酒庄庄主陈芳、理想国的梁文道，还有高晓松、冯唐等一众文化界人士在北京做了一场沙龙。他说相比知识或文化领地，葡萄酒肯定是体量相对比较小那个点，这个点如果可以和其他更大体量的领域结合，才能影响更多人，让更多人关注和喜欢上葡萄酒，所以想多做跨界是他的一个目标。“刚我说的一个目标，就是能够附着更大跨界，而且是更紧密的跨界，是一个有交流的，有相互需求的跨界，而不是贴上去，那种跨界才会更紧密。”

2.3 系统进化树构建 从 GenBank上下载各型HV序列，与15株 M 片段部分序列比对进行系统进化分析后可见进化树明显分为两支，其中 SNJ1 与 Bao14 处于同一分支， SNJ2-5 与 84FLi、 SN7 处于同一分支， SNJ6-12 与 HV114 等处于同一分支， SNJ15 与 Z37 处于同一分支，结合核苷酸同源性分析，可分别判断为HTNV H6、H5、H9亚型和SEOV S3 亚型。而 SNJ13、14 与各亚型病毒代表株之间的同源性均较低，结合进化树进化分支推测这2株病毒与HTNV已有的9个亚型存在一定差异，见图2。

图2 部分M片段核苷酸系统进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree of HV based on partial M segments

3 讨 论

南京都市圈是以南京为中心的经济区域带，位于长江中下游沿江城市地带核心地区，该区域受海陆热力性质差异的影响，为亚热带季风气候，雨热同期，有利于农业生产。而 HFRS 的发病与鼠类种群分布、气象因素、生态环境等因素密切相关[6]。南京及镇江、马鞍山等周边地区以丘陵地貌为主[7-8]，气候湿润，发病水平较高。在临床表现上， HFRS 与发热伴血小板减少综合征、登革热等疾病在临床症状上均会表现为发热、疼痛、出血倾向，故难以区分，需辅助实验室检查加以鉴别。本次研究中疑似患者大多因发热、乏力等非特异性症状就诊，少部分以胃肠炎、急性肾损伤、胸痛为首发症状，临床表现复杂多样，故在临床诊断的基础上开展样本的血清学、病原学检测尤为必要。

1.3 实时荧光RT-PCR检测 选用硕世生物科技有限公司生产的核酸提取试剂，经过样本裂解、核酸吸附、核酸纯化和核酸洗脱4个步骤获得提取好的核酸。使用该公司生产的汉滩病毒和汉城病毒核酸检测试剂盒，于PCR反应管中加入按照试剂盒说明书配置好的体系20 μL，再分别加入待测样本核酸，阴性对照，阳性对照各5 μL，设定好扩增参数，利用实时荧光RT-PCR法对样本进行检测分型。样本Ct值<37且出现典型的S型扩增曲线，则判断为阳性。

1.4.2 巢式PCR扩增 使用表1中提供的通用引物(10 μmol/L)和TAKARA PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒，按照试剂盒说明书，以提取好的核酸为模板，进行第一轮扩增。再以第1轮反应扩增产物为模板，分别使用HTNV、SEOV

特异性引物(10 μmol/L)作为巢式引物进行第二轮扩增。反应体系均参照试剂说明书。上述PCR反应扩增条件均为95 ℃预变性10 min，94 ℃ 60 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 45 s、扩增35个循环，72 ℃ 延伸12 min。

张守刚[11]，马涛[12]等学者对南京市HFRS流行特征分析结果表明南京市是混合型疫区,鼠种主要是小家鼠、黄胸鼠和褐家鼠等,本研究检测到HTNV和SEOV两种病毒株，与既往研究相符。但此次研究获得的SEOV病毒株数量较少，究其原因，可能是之前的研究对象是HV宿主动物，本研究则针对 HFRS 疑似患者，且 SEOV 引起的 HFRS 多为轻症且病程短[13]，故此型别患者的就诊率较低。

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汉坦病毒L、M和S片段中，变异最大的是M片段，且由 M 片段编码的包膜糖蛋白 Gn 和 Gc 与病毒的致病性有关，所以常被用来构建系统进化树和基因分型[14-15]。有研究表明，HTNV可分为9个亚型，SEOV为4～6个亚型[16]。本研究将获得的部分M片段序列与各亚型代表株构建遗传进化树，基因分型结果发现除了有13株与已知亚型一致，另有2株(SNJ13、14)处于 HTNV 大分支下，但与各已知亚型代表株核苷酸同源性均不高，表明南京市存在多种不同类型的流行株。在 NCBI 网站上进行 BLAST 序列比对，发现SNJ14与江西毒株AYW89-15 同源性较高，为98.5%，但结合患者流行病学调查发现该患者并未去过江西，而 GenBank 数据库中江苏省及附近周边地区可用的HV序列较少，因此，推测 SNJ14 为本地变异株或省外输入病毒株。而与 SNJ13 最接近的是河南省毒株 2017ZY21M，同源性为88.3%，差异较大，推测为本地变异株。

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近年来，常有HV新亚型的发现，这些新亚型在致病性上是否存在差异以及疫苗对其是否有保护效果，这些都需要进一步的研究。本次研究针对M基因的部分片段进行序列比对，序列片段较短，下一步将继续对M基因全长进行分段扩增，找出突变位点，为临床诊断及疫苗研制提供分子基础。

利益冲突：无

引用本文格式：董晓庆，石利民，王雅倩，等. 南京都市圈肾综合征出血热疑似病例血清学检测及基因亚型分析[J].中国人兽共患病学报，2022，38(4)：322-326. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.037