水质细菌总数FISH 检测技术的优化

汪 河，王 莉*，申慧彦，李卫华

（1.安徽建筑大学 环境与能源工程学院，安徽 合肥 230601；2.环境污染控制与废弃物资源化利用安徽省重点实验室，安徽 合肥 230601）

水质卫生检测的标准方法，国内外主要采用培养计数法[1]。这种方法虽具有易于标准化，结果可比性强的优点，但缺点也显而易见——耗时长（十几小时到几天不等），不能同时检测多种项目，且检测出的微生物数量由于培养手段的限制远远低于实际数量[2-3]。鉴于此，一系列快速检测方法如高光谱技术[4]、ATP 生物发光技术[5]、流式细胞计数法[6]和MTT 法[7]等不断开发出来。而分子生物学领域出现的荧光定量PCR 法[8]、原位杂交法[9]、荧光原位杂交法[10]等方法，则不仅实现了同时检测多种微生物指标的设想，而且大大突破了环境微生物数量的检测限度。

荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）是20 世纪80 年代初期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术[9]。其原理是把非放射性的荧光信号基团标记在特异性碱基序列的核酸探针上，再用带有荧光标记的探针与固定在玻片或滤膜上的细胞中特定的核苷酸序列进行杂交，然后在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和摄像。目前，FISH 技术已广泛应用于淡水、海洋、土壤和活性污泥的微生物数分布、丰度以及整个微生物群落组成、结构、多样性的观察[11-14]。然而，在水质卫生检测方面却鲜少见报道。限制FISH 技术应用的原因，很可能是因为该技术对实验条件要求高，杂质干扰、酶解条件不适、杂交条件不适、清洗脱落、荧光淬灭等都可能影响实验结果的稳定性[15-16]。本研究以水质细菌总数为主要观察指标，对FISH 技术的样品固定和杂交环节进行优化，旨在为FISH 技术日后在水质卫生检测的成熟应用奠定一定的技术基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

主要仪器：净化工作台（苏州净化SW-CJ-2D）；恒温干燥箱（上海阳光202-5SA）；恒温生化培养箱。

蛋白酶K 缓冲液（50 mL）：1 mol/L Tris-HCl（pH7.2）0.5 mL，0.5 mol/L EDTA 1 mL，5 mol/L NaCL 1 mL，10% SDS2.5 mL，20 mg/mL 蛋 白 酶K25 μL，44.98 mL ddH2O。

杂 交 缓 冲 液（2 mL）：5 mol/L NaCL360 μL，1 mol/L Tris-HCl（pH7.2）40 μL，10% SDS 2 μL，甲酰胺800 μL，798 μL d H2O。

洗脱液（50 mL）：5 mol/L NaCL 560 μL，1 mol/L Tris-HCl（pH7.2）1 mL，0.5 mol/L EDTA 500 μL，10% SDS 50 μL，47.89 mL d H2O。

1.2 样品的采集与固定

样品采集于安徽建筑大学校园内湖水。取水样1 000 mL 0.45 μm 滤膜过滤，5 mL 0.2 mol/L PBS（pH 7.2，灭菌）下清洗细菌。取0.5 mL 清洗水样加入0.5 mL 的冷冻乙醇固定，摇匀至-20 ℃保存。

1.3 FISH 过程及优化

实验中使用的探针为针对所有真细菌的EUB338-mix（5’-GCWGCCWCCCGTAGGWGT-3’）[17]，探针在5’末端用氨甲香豆素乙酸（AMAC）染料标记。FISH 基本操作按Nielsen[18]等人的方法：将10 μL 固定过的水样置于预先用0.1 mg/mL 多聚赖氨酸包埋的载玻片上，样品均匀摊开后干燥制片；蛋白酶K 缓冲液处理，灭菌水清洗；载玻片依次在50%、80%和100%（V/V%）的乙醇溶液中各脱水3 min，风干；杂交缓冲液和EUB338-mix 探针混合后加至载玻片覆盖样品区域，载玻片放入湿盒置于恒温生化培养箱在46 ℃杂交；48 ℃洗脱液中浸洗20 min；灭菌水清洗，风干备检。

在以下几个方面对FISH 过程进行优化：自然干燥5 h 和46 ℃烘烤制片（2 h、5 h）；蛋白酶K 消化时间（2 min、5 min、10 min）；探针终浓度（2.5 ng/μL、5 ng/μL、10 ng/μL）；杂 交 时 间（2 h、5 h、10 h）。

1.4 镜检和计数

样品通过荧光显微镜观察，AMAC 标记的FISH 信号通过紫外激发模块观察。所有数码照片都在40×的物镜下拍摄。每个FISH 条件样品准备3张杂化载玻片，每张载玻片随机拍摄20张照片。每张照片中发荧光的细胞数通过Image-Pro Plus 6.0 中的手动计数功能计数。

2 结果与分析

2.1 制片方式对细菌数量的影响

制片方式对细菌细胞数量的影响实验，截止在杂交步骤前。由材料与方法1.3 可知，FISH 过程的蛋白酶K 消化和杂交后洗涤环节都需要清洗，而清洗或多或少会引起粘附在载玻片上的细胞掉片。有效增加细胞粘附力的做法通常是用明胶、多聚赖氨酸等粘附剂预先包埋载玻片[11-14]。除此之外，有人发现将粘附有样品的载玻片37-60 ℃适当烘烤也能一定程度地减少细胞掉片[12-13，19]。本实验观察了自然干燥制片和46 ℃2 h、5 h）烘烤制片对载玻片细胞粘附力的影响。图1 可见，和自然干燥组（a）相比，46 ℃烘烤对增加载玻片细胞粘力有一定的促进作用，（b）和（c）细胞数量明显多于（a）。但烘烤时间延长至5 h 并不能明显减少洗涤过程中的细胞流失，（b）和（c）细胞数量无明显差异。因此下面实验制片采用46 ℃ 2 h 烤片。

图1 不同制片方式下的细菌数量图片

2.2 蛋白酶K 消化时间对杂交结果的影响

蛋白酶K 消化在FISH 中具有消化包围靶DNA 蛋白质的作用，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号。但蛋白酶K 的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时，都会对细胞结构有一定的破坏，影响细胞的完整性或导致细胞脱落，从而影响杂交结果。根据前人的经验[13，16，20]，终浓度10 μg/mL 温度37 ℃分别是FISH 检测中消化细菌靶DNA 蛋白质较佳的浓度和温度条件，而消化时间则需要根据样品去实际摸索。

由图2 和表1 可知，水中细菌总数的FISH 检测应设蛋白酶K 消化环节，和未用蛋白酶K 消化组（26±0.83）比，其他各组的荧光细胞数（＞ 70）均明显增加（和0 min 组相比，2 min 和5 min 组均P＜0.001，10 min 组P＜0.05）。蛋白酶K 消化时间控制在5 min 内较合适，继续消化会大大减少荧光信号。2 min（b）和5 min（c）消化组荧光信号数（128±5.66 和135±3.27）没有明显差异（P＞0.05），而当温度延长至10 min（d）时，荧光信号数量大大减少（72±1.62）（和5 min 组相比，P＜0.01）。下面的实验蛋白酶K 消化时间统一采用2 min。

表1 不同蛋白酶K 消化时间下的荧光细胞数量

2.3 探针终浓度对杂交结果的影响

FISH 检测中，一般来说，探针浓度越大，杂交率会越高。但探针浓度过高会造成背景染色过高，探针浓度过低又会导致荧光信号的不足。根据国内外多数研究人员[12-14，18，21]的经验，当探针终浓度为5 ng/μL 左右时，FISH 检测可以得到较佳的信噪比，我们的实验证实了相关研究的结果，图3 显示，随探针浓度增加，杂交信号越高。表1 可见，当探针浓度从2.5 ng/μL 增加至10 ng/μL 时，样品的荧光细胞数量也从61 ± 2.12 增加至232 ± 11.02（和2.5 ng/μL 组 相 比，5 ng/μL 组P ＜ 0.01，10 ng/μL 组P ＜ 0.001）。但需要注意的是，10 ng/μL 下的杂交背景稍高，因此，下面的实验探针杂交终浓度采用5 ng/μL。

图3 不同探针浓度下的细菌FISH 图片

表2 不同探针浓度下的荧光细胞数量

2.4 杂交时间对杂交结果的影响

杂交时间对杂交也有较大的影响。时间过短会造成杂交不完全，而过长则会增加非特异性杂交。据前人的经验表明，杂交时间因探针及样品的不同而不同，有的探针时间短至1-2 h[11，14，22]，有的探针需长至6 h 甚至过夜[20，23]。一般认为，寡核苷酸探针可在6 h 以内和目标细胞完成杂交[11，14，16，22]。图4 和表1 表明，5 h 是本实验比较合适的杂交时间，此时，寡核苷酸探针EUB338-mix 能与细菌细胞充分地结合。和5 h 相比，2 h 显然杂交尚未完成，荧光信号相对较低（5 h 250±13.83；2 h 158±8.51）（两组相比，P＜0.01）。而当时间延长至10 h，荧光信号并未明显提高（10 h 273±16.69）（和5 h 组相比，P＞0.05）。

图4 不同杂交时间下的总细菌FISH 图片

表3 不同杂交时间下的荧光细胞数量

2.5 条件优化后的FISH 定量结果比较

表4 显示了优化条件下（46 ℃ 2 h 制片，蛋白酶K 消化时间2 min，探针浓度5 ng/μL，46 ℃杂交5 h）的三次FISH 检测结果。显然，三次实验检测出的荧光细胞数量无明显差异（P＞0.05），分别为267±10.19、253±5.62 和272±16.07。可见，优化后的FISH 技术检测结果具有较高的稳定性，提示将FISH 检测技术应用于水的卫生检测是可行的。

表4 优化条件下的FISH 实验定量结果

3 结论

本研究主要针对FISH 在水质卫生检测中结果稳定性差的问题，在细胞制片、蛋白酶K 消化时间、探针杂交浓度和杂交时间四个方面对FISH 技术进行优化，得到如下结果：

（1）细胞制片烘烤比自然干燥好，适度烘烤可一定程度减少FISH 过程因洗涤造成的细菌细胞流失，46 ℃ 2 h 烘烤的合适条件。

（2）水质细菌总数的FISH 检测应设蛋白酶K消化环节，终浓度10 μg/mL 的蛋白酶K 37 ℃作用细菌细胞2 min，可得到较佳的信噪比。

（3）探针终浓度5 ng/μL，46 ℃ 5 h，可使寡核苷酸探针EUB338-mix 与细菌细胞充分地结合。

（4）条件优化后的FISH 定量结果稳定性较好，优化条件下FISH 技术三次检测的荧光细胞数量无明显差异。本研究结果为FISH 法日后在水质卫生检测的成熟应用奠定了一定的技术基础。