MsrA在肾透明细胞癌中的表达及其临床意义

张桂安，罗勇，董卫民，陈清标，钟惟德

（1.华南理工大学附属第二医院泌尿外科，广东广州510180；2.佛山市第二人民医院泌尿外科，广东佛山528000；3.广州医科大学附属第五医院泌尿外科，广东广州510799）

肾细胞癌是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的常见恶性肿瘤，其中70%以上的肾细胞癌都是肾透明细胞癌[1]。当前肾透明细胞癌的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，然而肾透明细胞癌患者的临床表现通常并不典型，通过影像学和病理学确诊时，多数患者已进入疾病晚期或发生转移，预后并不理想[2‑3]。因此，临床医师通过寻找到特异性高和敏感度强的生物标志物来诊断肾透明细胞癌，从而为患者提供最佳的个体化治疗方案，既可以避免患者高昂的医疗费用，又可以客观评估肿瘤的预后。

甲硫氨酸亚砜还原酶A（methionine sulfoxide reductase A，MsrA）是与抗氧化应激和维持蛋白稳定关系密切的一种抗氧化酶。研究表明MsrA 的过表达增强了对氧化应激的抵抗力，而MsrA空突变体对氧化应激表现得更敏感，并且氧化损伤是衰老的关键因素，MsrA能够维持蛋白稳定延缓衰老[4]。MsrA可能通过调控靶蛋白的功能和表达，参与活性氧介导的信号转导。MsrA在结直肠癌、胃癌和肝癌等多种肿瘤中表达更低，能下调肿瘤活性[5‑7]。但MsrA在肾透明细胞癌中的作用还没有相关文章报道。本课题拟研究TCGA 数据库和收集临床样本中的MsrA在肾透明细胞癌及其癌旁组织中的表达差异，通过分析MsrA 与临床数据特征和临床预后之间的关系，最后采用列线图来构建预测肾透明细胞癌患者的生存预后模型，从而为个体化治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究收集了佛山市第二人民医院5对肾透明细胞癌和癌旁组织标本，所有病例均为接受肾癌切除术，术前未行放射治疗或化学治疗。样本都由病理科医师通过HE染色明确诊断。

1.2 数据下载

从TIMER 数据库（http：//timer.cistrome.org/）下载MsrA 在泛癌中表达情况。从GEPIA 数据库（http：//gepia.cancer‑pku.cn/index.html）中下载得到MsrA 在肾透明细胞癌及其对照癌旁组织的差异表达情况。最后从TCGA 数据库下载TCGA‑KIRC 基因表达及其临床信息数据，在基因表达数据集中提取出MsrA mRNA 表达数据及其相对应的临床数据特征资料，包括年龄、性别、分级、临床分期、生存时间和生存状态。同时将表达数据和临床数据资料进行匹配，排除表达数据和临床信息不全的样本，最终得到526 例肾透明细胞癌组织和72 例癌旁组织进行后续的分析。

1.3 免疫组织化学染色

根据迈新试剂盒（货号：KIT‑9730）说明采用免疫组织化学染色检测MsrA 在肾组织标本中的蛋白表达水平。60 ℃烘烤切片1 h后在二甲苯和不同酒精浓度梯度中进行脱蜡，之后使用枸橼酸抗原修复液进行修复。过氧化酶阻断溶液室温孵育15 min以阻断内源性过氧化物酶的活性，再以非免疫性动物血清室温封闭30 min。一抗MsrA（1∶200，武汉Proteintech，货号：14547‑1‑AP）孵育过夜后予生物素标记的第二抗体室温孵育20 min，随后孵育链霉菌抗生物素‑过氧化物酶溶液。15 min 后进行二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染细胞核。免疫组化评分由2 位病理科医师独立确定，评分方法：以镜下阳性细胞百分比和染色强度评分。计算阳性染色细胞百分率，分为0（0～5%）、1（6%～25%）、2（26%～50%）、3（51%～75%）、4（76%～100%）。染色强度分为0（阴性）、1（弱）、2（中等）、3（强）。免疫组化评分由染色百分率与染色强度评分相乘确定。

1.4 统计学方法

使用R 4.1.1 和GraphPad Prism8 分析处理数据和绘制作图。配对样本中的表达量采用配对t检验，Wilcoxon秩和检验和Kruskal‑Wallis检验分别用于比较两组间和两组以上之间的非配对数据。生存曲线采用Kaplan‑Meier 检验绘制，森林图用于绘制单因素和多因素Cox 回归分析，列线图用于预测患者的生存预后。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MsrA 在肾透明细胞癌和癌旁组织中的表达情况

从TIMER 数据库中下载MsrA 表达的泛癌数据，发现MsrA 在肾透明细胞癌组织中的mRNA 表达水平低于癌旁组织（见图1A），这一结果在GEPIA数据库中得到了验证（P＜0.05，见图1B）。结合TCGA 数据库，在72 对肾透明细胞癌配对样本中，发现癌旁组织的表达高于肿瘤组织（P＜0.01，见图1C）。在免疫组织化学染色中，MsrA 阳性染色为棕黄色，在肾癌旁和肾透明细胞癌组织中主要表达在肾小管上皮的胞质内（见图1D，E），两组之间比较差异有统计学意义（P＜0.05，见图1F）。

图1 MsrA在肾透明细胞癌和癌旁组织中的表达差异Figure 1 Differential expression of MsrA in renal clear cell carcinoma and adjacent tissues

2.2 MsrA 表达与肾透明细胞癌临床数据特征的关系

在TCGA 数据库中，以MsrA mRNA 表达量中位数将MsrA 分为高表达组和低表达组，热图结果显示性别、临床分期的T分期和生存状态在MsrA高低两组中存在明显差异（见图2A）。为研究MsrA mRNA 表达量在不同临床数据特征条件下是否存在差异，本研究发现MsrA 的mRNA 表达量在女性中表达更高，随着分级和临床分期的增加，MsrA mRNA 表达量反而下降，而且在存活患者中的表达量更高（见图2B）。

图2 MsrA mRNA表达与肾透明细胞癌临床数据特征的关系Figure 2 Relationship between MsrA mRNA expression and clinical data characteristics of renal clear cell carcinoma

2.3 MsrA表达与肾透明细胞癌患者预后的关系

利用Kaplan‑Meier 生存曲线分析发现高MsrA mRNA 表达组的肾透明细胞癌患者总体生存率更高（P＜0.001，见图3A）。单因素和多因素Cox 回归分析发现MsrA mRNA 表达水平、年龄、分级和临床分期均是肾透明细胞癌患者总体生存率的影响因素，MsrA mRNA 高表达是肾透明细胞癌患者独立预后指标（见图3B、C）。

图3 MsrA表达与肾透明细胞癌患者预后的关系Figure 3 Relationship between MsrA expression and prognosis of patients with renal clear cell carcinoma

2.4 列线图预测模型构建

将多因素Cox回归有意义的临床变量纳入预测模型来绘制列线图。单个临床变量的不同赋值对应不同得分，将所有临床变量得分相加为总分，根据对应的总分即可找出该患者1、2 和3 年生存率（见图4A）。本研究同时构建了列线图预后模型校准图（见图4B），结果显示该模型实际观测的1、2、3年总体生存与参考曲线较为接近，表明该模型预测性能较强。

图4 列线图预测模型Figure 4 Nomogram prediction model

3 讨论

肾透明细胞癌是肾细胞癌中最常见的病理类型，而且也是发病率、死亡率、转移率最高的组织类型。虽然手术治疗和分子靶向药物治疗提高了肾透明细胞癌的生存预后，但目前仍缺乏对肾透明细胞癌患者诊断和预后的评估指标，寻找特异性高和敏感度强的诊断生物标志物，将对肾透明细胞癌患者针对性的个体化治疗治疗和预测预后有重要意义[8‑9]。

MsrA 是细胞内能清除活性氧的一种重要抗氧化酶，该基因位于8p22‑8p23 区带。在多种肿瘤发现MsrA基因高频缺失，该基因失活将导致机体内的活性氧清除障碍，而活性氧清除障碍在几乎所有肿瘤中都能观察到，并且活性氧在肿瘤的发生发展的生物学过程中起着关键作用[10]。胃黏膜感染幽门螺旋杆菌后会刺激中性粒细胞过度释放活性氧而出现持续的氧化应激和慢性免疫反应，最终导致DNA 损伤进展成胃癌[11]。MsrA 表达下降会使活性氧水平升高，PTEN下调，VEGF上调，以及磷酸肌醇3‑激酶通路的激活，从而导致细胞增殖和细胞外基质降解的增加，促进乳腺癌细胞的增殖和转移。有研究发现靶向肿瘤细胞和肿瘤基质细胞线粒体内的过氧化氢酶可抑制活性氧驱动的肿瘤进展和转移[12]。因此增加线粒体的抗氧化能力可成为抗肿瘤治疗的一个合理方法。MsrA 在防止氧化应激和增强氧化应激的抵抗力方面具有关键作用，保护细胞免受伤害。有研究表明，MsrA 可以保护肾脏细胞免受抗肿瘤化疗药物顺铂诱导的氧化应激、线粒体损伤和细胞凋亡的影响[13]。此外，MsrA可以通过减少氧化应激和炎症反应从而保护肾脏免受缺血‑再灌注损伤[14]。肾透明细胞癌的生长依赖于外源性的谷氨酰胺并展现出谷氨酰胺代谢重编程，而谷氨酰胺代谢途径能够提高肾透明细胞癌的抗氧化能力，从而抑制氧化应激[15]。在体外的动物实验表明，与邻近的正常和对侧的正常肾组织相比，肾透明细胞癌异种移植肿瘤表现出更高的氧化应激水平[16]。因此，MsrA 可能通过影响氧化应激从而影响肾透明细胞癌的发生、发展、转移过程，这可能成为一种治疗肾透明细胞癌的新靶点。

本研究中，与肾癌旁组织相比，MsrA 在肾透明细胞癌组织的表达水平较低，这表明MsrA 可能通过下调抗氧化酶的活性，使活性氧水平上升，促进了肿瘤的发生发展。此外MsrA 表达水平在男性较低，且随着分级和临床分期的增加反而下降，这说明MsrA 可能作为抑癌因子，其表达与肾透明细胞癌的恶性程度呈负相关。通过生存曲线发现MsrA高表达组患者的生存率更高，单因素和多因素Cox回归分析也表明MsrA mRNA 高表达是肾透明细胞癌患者良好预后的独立预后指标。本研究也构建一个新的预测模型并且具有相对较强的预测性能，通过列线图来预测肾透明细胞癌患者的生存预后以提供更好的个性化治疗方案。

综上所述，MsrA 在肾透明细胞癌中的表达减少，与正常肾脏组织的表达水平有显著差异。MsrA表达水平与肾透明细胞癌的临床病理特征和预后有关，MsrA 低表达是肾透明细胞癌不良预后的独立危险因素。对MsrA 的研究为今后肾透明细胞癌的肿瘤分子靶向药物的研发和科学治疗起到积极的推动作用。