超声波辅助提取骨碎补总黄酮的工艺研究*

韦国兰, 龙杰凤, 白 凤

骨碎补(Rhizoma Drynaria)为水龙科多年生蕨类植物槲蕨[Drynaria fortunei(Kunze)J. Sm. ]干燥根茎[1], 是骨伤科常用中药材。 具有止痛、 补肾健骨的功效, 常用于肾虚腰痛, 耳鸣耳聋, 牙齿松动, 跌扑闪挫, 筋骨折伤[2]等。 骨碎补含有多种有效活性成分, 其中主要活性成分为黄酮类化合物, 其具有抗氧化、 抗炎、 镇痛[3-5]、 神经保护作用[6-8]、 促进骨折愈合[9]、调节免疫[10]的作用。 鉴于此, 本试验以骨碎补为原料, 以乙醇为提取溶剂, 采用超声波辅助提取法对骨碎补中总黄酮进行提取工艺优化, 以期为骨碎补的进一步研究提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

骨碎补购于凯里市中药材市场, 去杂后于烘箱中干燥至恒重, 再粉碎、 过80 目筛, 样品粉末放入密封袋避光保存, 待用; 所用试剂为芦丁、 亚硝酸钠、 硝酸铝、 氢氧化钠、 甲醇等都为市售。

WGLL-230BE 电热鼓风干燥箱, 天津市泰斯特仪器有限公司; FW400A 高速万能粉碎机, 北京科伟永兴仪器有限公司;JP-040 超声波清洗机, 深圳市洁盟清洗设备公司; TD5M 低速离心机, 长沙湘智离心机仪器有限公司; UV-2550 紫外分光光度计, 岛津企业管理中国有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 标准曲线的绘制

芦丁标准曲线的制作参照文献[11]: 准确称取0.1260 g 芦丁标准品于150 mL 烧杯中, 并用100 mL 的70%乙醇溶液溶解后转移至1000 mL 容量瓶中, 并定容至刻度, 摇匀静置。 分别吸取该标准溶液1.0 mL、 2.0 mL、 3.0 mL、 4.0 mL、 5.0 mL于5 个25 mL 比色管中, 再分别加入70%乙醇溶液至5.0 mL,混合均匀, 再加入5%亚硝酸钠溶液0.5 mL, 混合均匀, 静置6 min。 加入0.5 mL 10%硝酸铝溶液, 混合均匀, 放置6 min,再加入4 mL 4%氢氧化钠溶液, 混合均匀。 放置15 min, 并于510 nm 波长处测定其吸光度。 以芦丁浓度(X)为横坐标, 吸光度(Y)为纵坐标, 绘制标准曲线。 其回归方程为: Y=11.701X-0.0057(R2=0.9996)。 由此可见, 此方程线性良好。

1.2.2 骨碎补总黄酮得率的结果计算

总黄酮得率(%)=(C×V×稀释倍数)×100% /M式中: C 为标准样液浓度, mg/mL; V 为样品体积, mL;M 为称取样品质量, mg。

1.2.3 单因素试验1.2.3.1 乙醇浓度对骨碎补总黄酮提取的影响

精密称取2.0 g 骨碎补粉末5 份, 放入相应的5 个250 mL圆底烧瓶中, 按固定料液比为1 ∶10 比例分别加入50%、60%、 70%、 80%、 90%浓度的乙醇, 用保鲜膜封口, 在温度为40 ℃条件下超声提取15 min 后放置室温, 抽滤, 滤液转入100 mL 容量瓶定容至刻度。 根据1.2.1 测定其吸光度。

1.2.3.2 料液比对骨碎补总黄酮提取的影响

精密称取2.0 g 骨碎补粉末5 份, 放入相应的5 个250 mL圆底烧瓶中, 以40%乙醇溶液为提取剂, 以按1∶5、 1∶10、1∶15、 1∶20、 1∶25 为料液比, 用保鲜膜封口, 在温度为40 ℃条件下超声提取15 min 后放置室温, 抽滤, 滤液转入100 mL 容量瓶定容至刻度。 根据1.2.1 测定其吸光度。

1.2.3.3 提取时间对骨碎补总黄酮提取的影响

精密称取2.0 g 骨碎补粉末5 份, 放入相应的5 个250 mL圆底烧瓶中, 按固定料液比为1∶10 加入70%的乙醇, 用保鲜膜封口, 在温度为40 ℃条件下超声提取时间依次为15 min、30 min、 45 min、 60 min、 75 min 后, 放置室温, 抽滤, 滤液转入100 mL 容量瓶定容至刻度。 根据1.2.1 测定其吸光度。

1.2.3.4 提取温度对骨碎补总黄酮提取的影响

精密称取2.0 g 骨碎补粉末5 份, 放入相应的5 个250 mL圆底烧瓶中, 按固定料液比为1∶10 加入70%的乙醇, 设置超声温度分别为40 ℃、 50 ℃、 60 ℃、 70 ℃、 80 ℃, 超声提取30 min 后, 放置室温, 抽滤, 滤液转入100 mL 容量瓶定容至刻度。 根据1.2.3 测定其吸光度。

1.2.4 正交试验

在单因素试验的基础上, 采用L9(34)正交实验优化提取工艺参数。 因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal experiment

2 结果与讨论

2.1 乙醇浓度对骨碎补总黄酮提取的影响

根据图1 可知, 当乙醇浓度为50% ～70%之间, 骨碎补总黄酮得率随乙醇浓度增大逐渐增大, 当料液比为70%时总黄酮得率最大, 随后慢慢降低。 故正交试验设计中选取提取乙醇浓度为60% ～80%。

图1 乙醇浓度不同对总黄酮提取的影响Fig.1 Influences of ethanol concentration on total flavonoids yield

2.2 料液比对骨碎补总黄酮提取的影响

根据图2 可知, 当料液比为1∶5 ～1∶15 之间, 骨碎补总黄酮得率随料液比加大逐渐增大, 当料液比为1∶15 时总黄酮得率最大, 随后慢慢降低。 故正交试验设计中选取提取料液比为1∶10 ～1∶20。

图2 料液比不同对总黄酮提取的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on total flavonoids yield

2.3 提取时间对骨碎补总黄酮提取的影响

根据图3 可知, 当超声提取时间为15 ～45 min 时, 骨碎补总黄酮得率随提取时间增加而逐渐增大, 当超声提取时间达45 min 时, 这时总黄酮得率最大, 60 min 后总黄酮得率逐渐降低。 故正交试验设计中选取提取时间为30 ～60 min。

图3 提取时间不同对总黄酮提取的影响Fig.3 Effect of extraction time on total flavonoids yield

2.4 提取温度对骨碎补总黄酮提取的影响

根据图4 可知, 当提取温度在40 ～70 ℃时, 骨碎补总黄酮得率逐渐增大, 当提取温度达70 ℃时, 这时总黄酮得率最大,70 ℃后总黄酮得率逐渐降低。 故正交试验设计中选取提取时间为60 ～80 ℃。

图4 提取温度不同对总黄酮提取的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on total flavonoids yield

2.5 骨碎补总黄酮提取工艺的优化

在单因素试验结果的基础上设计正交试验方案, 选取各因素中骨碎补总黄酮得率较高三个水平进行正交试验。 正交实验结果见表2。

表2 正交试验方案及结果Table 2 Orthogonal experimental results

由表2 中极差分析可知, 影响骨碎补总黄酮提取效果的因素主次顺序为: A(乙醇浓度)＞B(料液比)＞D(提取温度)＞C(提取时间), 最佳工艺为A2B2C1D3, 即乙醇浓度为70%、料液比为1∶15、 提取时间为30 min、 提取温度80 ℃。 从表2中可知, 在实际实验的9 组试验中骨碎补总黄酮提取效果最好的是第5 组试验(A2B2C3D1), 故对A2B2C1D3进行验证实验,验证实验结果为总黄酮得率为7.53%, 得率稍大于第5 组试验(A2B2C3D1), 由此证明A2B2C1D3骨碎补总黄酮提取的最佳工艺。

3 结 论

在单因素的基础上, 采用正交设计对骨碎补总黄酮提取工艺进行优化, 得到骨碎补中黄酮的最佳提取工艺条件为:A2B2C1D3, 即乙醇浓度为70%、 料液比为1∶15、 提取时间为30 min、 提取温度80 ℃。 此方法低成本、 快速, 可为骨碎补的开发利用提供一定理论依据。